幽門螺桿菌外膜蛋白18識別干擾素gamma輔助幽門螺桿菌在胃部長期定植.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的革蘭氏陰性菌，定植于全世界約一半的人體內(nèi)。在大部分帶菌者體內(nèi)，H.pylori感染引起的慢性胃炎是無癥狀的，但卻被認為是十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃癌及黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤的主要致病因素。在不使用抗生素的情況下，H.pylori能夠持續(xù)定植于人體胃組織，表明宿主免疫反應無效。同時，H.pylori耐藥

2、率不斷升高，多數(shù)抗生素已經(jīng)無法控制H.pylori感染的蔓延，因此，對于H.pylori免疫逃逸機制的研究顯得尤為重要。
　　H.pylori感染誘導胃竇部黏膜的慢性及活動性炎癥反應，并伴隨有B細胞、T細胞及中性粒細胞的浸潤。雖然所有的H.pylori菌株都能夠引起胃炎，但是與cagA-的菌株相比，cagA+的H.pylori感染大大提高了嚴重性胃炎，萎縮性胃炎及胃癌的發(fā)病率，而且cagA+的H.pylori引起更強烈的IL-8的

3、分泌。胃上皮細胞在急慢性H.pylori感染的過程中起重要作用，H.pylori能夠激活胃上皮細胞的多種信號轉(zhuǎn)導通路，激活信號通路的結果之一就是產(chǎn)生大量的IL-8。H.pylori引起的慢性活動性胃炎的胃黏膜組織中大量中性粒細胞的浸潤被認為是對H.pylori的中性粒誘導因子（尿素酶，NapA）的應答。
　　IFN-γ能夠誘導炎癥反應，保護機體抵抗細菌感染。IFN-γ激活免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)包括吞噬作用及抗原提呈，誘導抗原提呈細胞M

4、HCⅡ的表達并激活巨噬細胞及自然殺傷細胞，因此IFN-γ在免疫反應中起重要作用。信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)是IFN-γ信號通路的重要分子，IFN-γ能夠激活STAT1并提高其磷酸化水平，p-STAT1激活一氧化氮合酶(iNOS)并促進一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。NO作為IFN-γ信號通路的效應分子，是宿主抵抗病原菌感染的基礎分子，能夠抑制對數(shù)期病原菌的生長。
　　病原菌具有能夠與宿主相接觸的多種表面結構（包括菌毛，鞭毛，外

5、膜蛋白以及多種分泌系統(tǒng)）用以調(diào)節(jié)細菌對宿主細胞的黏附及入侵。革蘭陰性菌外膜蛋白是一種復雜的結構，主要功能是輔助細菌適應多變的外部環(huán)境。外膜蛋白能夠主動的，有選擇性的控制重要物質(zhì)（多肽或蛋白質(zhì)，核酸以及脂質(zhì)、多糖等）的流入及排出。編碼H.pylori外膜蛋白的基因約有33種，大多數(shù)外膜蛋白位于膜的表面，其主要功能包括對宿主細胞的粘附及攝取營養(yǎng)物質(zhì)。
　　雖然H.pylori引起強烈的炎癥反應但是宿主免疫系統(tǒng)不能夠清除該菌，表明H.p

6、ylori具有免疫逃逸機制。H.pylori免疫逃逸機制包括誘導極化的免疫應答、調(diào)節(jié)吞噬作用及中性粒細胞的功能以及抑制淋巴細胞增值。研究表明，H.pylori能夠結合IFN-γ并下調(diào)主要毒力因子CagA的表達。但是目前尚未有H.pylori結合IFN-γ的具體機制的相關報道，本論文通過基因芯片篩選出H.pylori外膜蛋白Omp18，并進一步證實Omp18能夠結合IFN-γ輔助H.pylori長期定植，有助于提高H.pylori在NO壓

7、力下的生存力及抗吞噬作用。
　　方法：
　　1.通過基因芯片方法篩選出H.pylori野生株在IFN-γ作用下發(fā)生表達變化的基因。用IFN-γ處理培養(yǎng)至對數(shù)期的H.pylori野生株8h，未處理組作為對照，分別進行基因芯片檢測，通過比較找出IFN-γ作用下發(fā)生表達變化的基因。
　　2.通過Real-TimePCR法驗證基因芯片結果。用IFN-γ處理培養(yǎng)至對數(shù)期的H.pylori野生株，分別于0h，2h，4h，8h收集菌

8、液，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-TimePCR檢測omp18的表達。
　　3.檢測H.pylori野生株毒力因子CagA、NapA在IFN-γ作用下的表達情況。H.pylori野生株及omp18突變株過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用IFN-γ處理8h，未處理組作為對照，收集菌液分別用于提取細菌總蛋白及RNA，通過westernblot及Real-TimePCR檢測毒力因子CagA、NapA的表達情況。
　　4.動物實驗

9、。將H.pylori野生株及omp18突變株分別多次經(jīng)口感染蒙古沙鼠，分別于末次感染后第2，4，6，8周脫頸處死蒙古沙鼠，取其胃竇組織進行細菌的分離培養(yǎng)檢測H.pylori定植情況，并通過H&E染色鑒定胃組織炎癥狀況，應用Real-TimePCR及ELISA檢測胃組織炎性因子表達情況。
　　5.檢測H.pylori野生株及omp18突變株生存能力的差異。
　　(1)用硝普鈉(SNP)處理培養(yǎng)至對數(shù)期的H.pylori野生株及

10、omp18突變株，分別通過瓊脂稀釋法及熒光染色法比較H.pylori野生株及omp18突變株的生存力。
　　(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的H.pylori野生株及omp18突變株分別加入至培養(yǎng)巨噬細胞的孔板中，分別于第2h，6h，24h裂解巨噬細胞并將含有H.pylori的裂解液經(jīng)梯度稀釋后涂布至瓊脂平板上，培養(yǎng)3-5天后計數(shù)單克隆。
　　6.通過免疫熒光的方法證實H.pylori外膜蛋白Omp18能夠結合IFN-γ。
　

11、　7.T-COFFEE軟件分析Omp18，OprF及干擾素結合區(qū)域蛋白序列。
　　8.通過westernblot比較H.pylori野生株與omp18突變株刺激后巨噬細胞p-STAT1蛋白的表達差異。
　　9.NO測定。將H.pylori感染后的巨噬細胞及沙鼠胃組織分泌的亞硝酸鹽的含量作為NO分泌的間接指標并通過Griess反應測定。
　　結果：
　　1.IFN-γ刺激下H.pyloriOmp18表達升高?；蛐?/p>

12、片發(fā)現(xiàn)與未處理的菌株相比，經(jīng)10ng/mLIFN-γ處理后H.pylori野生株Omp18表達升高。
　　2.T-COFFEE軟件分析發(fā)現(xiàn)Omp18序列與OprF序列以及干擾素gamma感受器1(IRF1)的干擾素結合域相似度很高。
　　3.免疫熒光證實IFN-γ能夠與H.pyloriOmp18結合。
　　4.IFN-γ下調(diào)H.pylori野生株毒力因子的表達。Westernblot及Real-TimePCR發(fā)現(xiàn)經(jīng)10

13、ng/mLIFN-γ處理后H.pylori野生株CagA及NapA表達下降，而omp18突變株中CagA及NapA表達上升。
　　5.H.pyloriomp18突變株在蒙古沙鼠胃組織中存在定植缺陷。動物實驗表明H.pylori野生株及omp18突變株均可在蒙古沙鼠胃部定植;omp18突變株在蒙古沙鼠胃組織的定植力明顯低于野生株，第8周差異最明顯。
　　6.H.pyloriomp18突變株感染誘導強烈的炎癥反應。與野生株感染的

14、蒙古沙鼠相比，omp18突變株感染的蒙古沙鼠胃組織表現(xiàn)出更多的中性粒細胞浸潤及更嚴重的組織損傷;Real-TimePCR及ELISA檢測發(fā)現(xiàn)omp18突變株誘導蒙古沙鼠胃組織分泌更多的炎性因子;同樣，omp18突變株感染誘導AGS細胞分泌更多IL-8，誘導巨噬細胞分泌更多MIP-2，特別是在IFN-γ存在時。
　　7.H.pyloriomp18突變株感染上調(diào)NO表達。在10ng/mLIFN-γ作用下，H.pylori野生株而非om

15、p18突變株能夠抑制巨噬細胞p-STAT1的表達;而omp18突變株能夠誘導巨噬細胞以及蒙古沙鼠胃組織NO高表達。
　　8.Omp18有助于提高H.pylori野生株在氧應激下的生存力及抗吞噬作用。在SNP刺激下，與H.pylori野生株相比，omp18突變株生存力急劇下降，且絕大多數(shù)突變株由正常的螺桿狀變?yōu)榍蛐?同樣，omp18突變株在巨噬細胞中生存力減弱。
　　結論：
　　H.pylori能夠通過Omp18主動感應