實(shí)現(xiàn)黏附因子FimH在幽門螺桿菌中外膜展示.pdf

1、幽門螺桿菌是一種致病菌，能夠在胃粘膜長期定植，導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍甚至胃癌等嚴(yán)重胃部疾病，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將其列為Ⅰ類致癌原。幽門螺桿菌在世界范圍內(nèi)感染率高達(dá)50％以上，傳統(tǒng)的藥物治療方法由于費(fèi)用、副作用及耐藥株的出現(xiàn)而受到限制。開發(fā)疫苗用于預(yù)防或治療幽門螺桿菌具有重大意義，而現(xiàn)有的各種動物評價系統(tǒng)存在一定缺陷，使用最廣泛的小鼠感染模型存在定植不穩(wěn)定的現(xiàn)象。本課題旨在通過基因敲入技術(shù)將外源黏附因子——鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛黏附蛋白FimH或

2、其黏附結(jié)構(gòu)域?qū)胗拈T螺桿菌基因組中，實(shí)現(xiàn)外源黏附因子與幽門螺桿菌自身外膜蛋白Lpp20和Omp18融合表達(dá)并在外膜展示，以增強(qiáng)幽門螺桿菌在小鼠胃腸黏膜中的定植能力。
　　在實(shí)驗(yàn)的第一部分中，我們對幽門螺桿菌的基因打靶技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。從培養(yǎng)基、抗生素、感受態(tài)濃度、孵育時間及同源臂長度對基因打靶系統(tǒng)進(jìn)行了細(xì)致的考察。通過比較發(fā)現(xiàn):在含血清的培養(yǎng)基中幽門螺桿菌生長旺盛，相對于全血培養(yǎng)基能夠縮短打靶周期;在抗生素選擇壓力方面，卡那霉素相對

3、于氯霉素更能夠避免假陽性的出現(xiàn);感受態(tài)細(xì)菌濃度在2×109cfu/ml以上時能夠得到轉(zhuǎn)化子，但在2×1010cfu/ml時，可以成功獲得更多的轉(zhuǎn)化子;電擊后孵育時間為24h時，轉(zhuǎn)化效率較高;在300-700bp考察范圍之內(nèi)的同源臂長度對于基因敲除轉(zhuǎn)化效率影響不顯著。通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二次轉(zhuǎn)涂可以極大地提高轉(zhuǎn)化率，使打靶重組子更容易獲得。
　　構(gòu)建了四種基因敲入的打靶載體p-Lpp20-FimH、p-Lpp20-FimH(Ld)、p

4、-Omp18-FimH及p-Omp18-FimH(Ld)，利用基因敲入技術(shù)將其導(dǎo)入到幽門螺桿菌26695中，使fimH基因或其黏附結(jié)構(gòu)域基因片段fimH(ld)與幽門螺桿菌外膜蛋白基因lpp20或omp18融合表達(dá)。利用交叉引物對其進(jìn)行基因組水平上的驗(yàn)證，證明外源基因fimH或fimH(ld)已經(jīng)整合在幽門螺桿菌26695基因組指定位置;在轉(zhuǎn)錄水平上，利用RT-PCR技術(shù)對fimH或fimH(ld)的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了lpp20-f

5、imH, lpp20-fimH(ld)，omp18-fimH, omp18-fimH(ld)融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在。將fimH基因表達(dá)在大腸桿菌中，獲得了FimH重組蛋白。對FimH重組包涵體蛋白進(jìn)行洗滌純化后，免疫新西蘭大耳白兔，獲得了針對FimH的多克隆抗體，抗體效價為1∶10000。通過超速離心的方法提取了幽門螺桿菌26695四個重組菌株的外膜蛋白，利用Western Blot檢測外膜蛋白中FimH的表達(dá)。結(jié)果證明可以在重組菌株H