幽門螺桿菌CagA基因克隆及表達.pdf

1、背景與目的：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌，并與胃癌和胃粘膜相關性淋巴瘤的發(fā)生密切相關。根據Hp是否含有細胞毒素相關蛋白編碼基因(cytotoxin-associatedproteingeneA，CagA)和空泡毒素相關蛋白編碼基因(Vacuolatingcytotoxin-associatedproteingeneA，VagA)將Hp分為Ⅰ型菌株(CagA+、VagA+)和Ⅱ型

2、菌株(CagA-、VagA-)兩種。Ⅰ型菌株含有一個約40kb的特殊基因片段，因其編碼CagA等毒力因子而被稱為cag毒力島。1997年到1998年，2個HpⅠ型菌株26695菌株和J99菌株的基因組被完全測序，使人們能夠全面了解HpⅠ型菌株的基因組結構和主要特征。鑒于Ⅰ型菌株現被認為是消化道潰瘍和胃腫瘤的重要成因，因此CagA基因的研究成為Hp研究中的熱點。目前，對于治療Hp感染主要應用抗生素和質子泵抑制劑，但抗生素的廣泛應用會導致H

3、p耐藥性的不斷增加，且價格昂貴，復發(fā)的機率較大。因此，預防Hp的感染十分必要和緊迫。但目前尚未研制出實用有效的HpⅠ型菌株疫苗。為此，本研究擬利用分子生物學技術，建立CagA的原核表達系統(tǒng)，為Hp重組疫苗的研制提供備選抗原，同時也為HpⅠ型菌株的鑒定試劑盒提供抗原參考。 方法：根據GenBank收錄的HpCagA序列，設計PCR引物，并在每條引物前分別添加內切酶位點。通過PCR擴增Hp菌株的CagA基因，運用分子克隆的經典方法，

4、用pGEM-TEasy載體攜帶該基因轉化工程菌JM109，繼而通過藍白實驗篩選出陽性菌落并對該基因進行測序，將其結果與已公布的CagA基因序列比對。測序結果正確后再將CagA基因從pGEM-TEasy-CagA質粒中切出，用表達載體pGEX-5X-1攜帶該基因轉化宿主菌BL21(DE3)，通過氨芐青霉素抗性篩選和菌落PCR挑選出陽性克隆pGEX-5X-1-CagA。而后以IPTG誘導含pGEX-5X-1-CagA的宿主菌表達融合蛋白，經

5、SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達情況，并用Western-blot鑒定融合蛋白的抗原性。 結果：1.靶基因擴增：從Hp菌株中，利用PCR擴增得到CagA目的基因(570bp)，加上兩端內切酶位點共586個堿基對。 2.成功構建pGEM-T-CagA原核重組質粒，目的CagA基因的測序結果均與GenBank公布的同源性達100％，對應蛋白序列同源性100％。 3.成功構建pGEX-5X-1-CagA，并經SDS

6、-PAGE凝膠電泳分析結果表明，含pGEX-5X-1-CagA的BL21(DE3)宿主菌經IPTG誘導后能表達出GST-CagA融合蛋白，分子量大小與預期相一致(48KD)。 4.Western-blot檢測結果顯示該融合蛋白可與抗-CagA蛋白結合反應。 結論：1.成功獲得HP菌株CagA保守區(qū)基因序列，經測序分析其與GenBank上該序列的同源性達100％。 2.成功構建原核表達質粒pGEX-5X-1-Cag