幽門螺桿菌CagA介導Cdx2調(diào)控p21表達的信號轉(zhuǎn)導.pdf

1、胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來患病率逐年上升且日益年輕化。幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，并與胃腺癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)病密切，但其致瘤分子機制尚不清楚。 細胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxinassociated-geneA,CagA)是Hp的重要毒力因子，通過細胞毒素相關(guān)因子致病性島Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretionsystem,TFSS

2、)導入細胞后被內(nèi)源性Src絡氨酸蛋白激酶(Srchomology2(SH2)-containingtyrosinephosphatase，SHP-2)磷酸化，然后與SHP-2磷酸酶的結(jié)合并誘發(fā)其活化。磷酸化的CagA觸發(fā)一系列的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路變化；而使用SHP-2特異性磷酸酶抑制劑calpeptin可完全抑制SHP-2，阻斷這一信號轉(zhuǎn)導通路引發(fā)的生物學行為改變。 p21/WAF1/CIP1(p21)是目前已知的具有最廣泛激酶

3、抑制活性的細胞周期素依賴性激酶抑制子(Cyclin-dependentkinaseinhibitor,CDKI)，在細胞周期中起負性調(diào)節(jié)作用，抑制細胞增殖，使細胞周期不能進入S期而停滯在G1期。p21與各種細胞周期素Cyclin以及細胞周期素依賴性激酶CDK(Cyclin-dependentkinase)組成了細胞周期抑制因子與激活因子網(wǎng)絡，共同調(diào)節(jié)細胞周期的轉(zhuǎn)換及動態(tài)平衡。由于p21的異常轉(zhuǎn)錄或表達與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它被

4、認為是一個重要的抑癌基因。在胃癌發(fā)生發(fā)展的多階段過程中，隨著胃黏膜病變惡性程度的增高而p21表達降低。 本研究擬從Hp毒性因子CagA入手，以CagA野生型及其同基因突變體CagA突變型Hp菌株為實驗對照誘導體系，研究幽門螺桿菌CagA介導Cdx2調(diào)控p21表達的信號轉(zhuǎn)導，并結(jié)合Cdx2及p21在胃癌癌變多階段病變過程中的表達情況，探討Cdx2及p21在腸型胃癌發(fā)病中的可能機制。 本研究分兩部分： 第一部分幽門螺

5、桿菌CagA介導Cdx2調(diào)控p21表達的信號轉(zhuǎn)導 第1節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導AGS胃癌細胞Cdx2表達失調(diào) 目的：觀察幽門螺桿菌CagA誘導的AGS胃癌細胞Cdx2核移位改變以及對Cdx2表達水平的影響。 方法：采用CagA野生型和CagA突變型Hp菌株，以不加幽門螺桿菌菌株為空白對照，分別誘導人胃癌細胞株AGS(幽門螺桿菌與細胞比例為100：1)，根據(jù)實驗需要在不同時間點收獲細胞。采用間接免疫熒光法聯(lián)合激光共

6、聚焦熒光顯微鏡技術(shù)(LCFM)觀察幽門螺桿菌CagA誘導Cdx2核移位改變，Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR分別用于觀察Cdx2蛋白及mRNA的表達。 結(jié)果：LCFM顯示，加入CagA野生型幽門螺桿菌誘導前，AGS細胞Cdx2蛋白主要表達在胞漿，加入CagA野生型幽門螺桿菌誘導后，Cdx2蛋白在細胞核的分布逐漸增多，并呈時間依賴性增強，提示在CagA野生型幽門螺桿菌誘導下，Cdx2蛋白由胞漿移位到胞核

7、；而在CagA突變型幽門螺桿菌中，Cdx2蛋白的核移位不如CagA野生型幽門螺桿菌誘導明顯；而在未加幽門螺桿菌菌株的空白對照組沒有觀察到Cdx2由細胞漿向細胞核的移位。用calpeptin處理后，CagA野生型Hp誘導下AGS細胞的Cdx2核移位較處理前減弱。 RT-PCR和RealTimePCR結(jié)果均顯示，cagA野生型Hp誘導下AGS細胞的Cdx2mRNA表達呈時間依賴性增加；在誘導后12小時時間點對比AGS細胞分別在cag

8、A野生型及cagA突變型Hp作用下的Cdx2mRNA表達，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導的Cdx2mRNA表達水平明顯高于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導細胞Cdx2mRNA水平明顯下降，而在cagA突變型Hp誘導細胞中Cdx2下調(diào)不明顯。 Westernblot結(jié)果顯示，cagA野生型Hp誘導下AGS細胞的Cdx2蛋白表達呈時間依賴性增加，12小時達到高峰并維持在較高水平，因此，我們在12小時時

9、間點進行阻斷實驗；在誘導后12小時時間點對比AGS細胞分別在cagA野生型及cagA突變型Hp作用下的Cdx2蛋白表達，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導的Cdx2蛋白表達水平明顯高于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導細胞Cdx2蛋白水平明顯下降，而在cagA突變型Hp誘導細胞中Cdx2蛋白下調(diào)不明顯。 結(jié)論：幽門螺桿菌CagA可誘導轉(zhuǎn)錄因子Cdx2核移位改變，并導致Cdx2在mRNA及蛋白質(zhì)表達水平上

10、調(diào)。 第2節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導AGS胃癌細胞Cdx2失調(diào)引發(fā)p21異常表達 目的：研究Cdx2在p21啟動子區(qū)是否具有結(jié)合活性，并探討幽門螺桿菌CagA在AGS胃癌細胞誘導的Cdx2失調(diào)能否引發(fā)p21的異常表達。 方法：用非同位素凝膠移動遷移率檢測方法(SUPER-EMSA)檢測檢測轉(zhuǎn)錄因子Cdx2與DNA結(jié)合狀態(tài)；Westernblot、RT-PCR和RealTimePCR方法觀察cagA野生型/突變型Hp

11、誘導下以及calpeptin阻斷后AGS細胞的p21mRNA和蛋白表達變化。 結(jié)果：EMSA顯示，在cagA野生型Hp誘導下AGS細胞Cdx2與p21探針結(jié)合，呈時間依賴性增強；cagA突變型Hp誘導下AGS細胞Cdx2與p21探針結(jié)合能力明顯下降。 RT-PCR和RealTimePCR結(jié)果均顯示，cagA野生型Hp誘導下AGS細胞的p21mRNA表達呈時間依賴性下調(diào)；在誘導后12小時時間點對比AGS細胞分別在cagA野

12、生型及cagA突變型Hp作用下的p21mRNA表達，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導的p21mRNA表達水平明顯低于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導細胞p21mRNA水平明顯上調(diào)，而在cagA突變型Hp誘導細胞中p21上調(diào)不明顯。 Westernblot結(jié)果顯示，cagA野生型Hp誘導下AGS細胞的p21蛋白表達呈時間依賴性減少；在誘導后12小時時間點對比AGS細胞分別在cagA野生型及cagA突變

13、型Hp作用下的p21蛋白表達，發(fā)現(xiàn)cagA野生型Hp誘導的p21蛋白表達水平明顯低于cagA突變型Hp；calpeptin處理后，cagA野生型Hp誘導細胞p21蛋白水平明顯增強，而在cagA突變型Hp誘導細胞中p21蛋白增強不明顯。 結(jié)論：Cdx2與p21啟動子區(qū)結(jié)合位點(TTTAT)結(jié)合，幽門螺桿菌CagA誘導Cdx2表達失調(diào)導致p21的異常表達。 第3節(jié)幽門螺桿菌CagA誘導下p21異常表達導致胃癌細胞周期的異常改

14、變 目的：研究幽門螺桿菌CagA誘導下細胞周期各個時相細胞的動態(tài)變化以及相關(guān)p21蛋白含量表達。 方法：利用流式細胞術(shù)分析幽門螺桿菌CagA誘導下細胞周期各個時相的動態(tài)變化，并采用DNA含量和平均熒光強度雙參數(shù)方法檢測p21蛋白實時表達。 結(jié)果：cagA野生型Hp誘導下，隨著時間推移，AGS細胞G1期細胞下降，S期細胞明顯增加，G2期的細胞無明顯變化；在12小時時間點進行阻斷實驗，結(jié)果顯示：與cagA野生型Hp相

15、比，cagA突變型Hp誘導AGS細胞G1期細胞增加；同時S期細胞下降，G2期的細胞無明顯變化，上述效應與cagA密切相關(guān)。 cagA野生型Hp誘導AGS細胞后，與對照組相比，AGS細胞p21相對熒光強度逐漸下降；在12小時時間點進行阻斷實驗，結(jié)果顯示：與cagA野生型Hp相比，cagA突變型Hp誘導AGS細胞12小時后，AGS細胞p21相對熒光強度相對增強，p21的相對熒光強度改變與cagA密切相關(guān)。 結(jié)論：幽門螺桿菌C

16、agA可誘導p21異常表達，引發(fā)細胞周期失調(diào)。 第二部分Cdx2和p21在胃癌癌變多階段組織中蛋白表達和意義 目的：在前期研究基礎(chǔ)上，檢測Cdx2及p21在人體胃癌癌變多階段組織中的表達，進一步在體內(nèi)水平驗證其在腸型胃癌演變過程中的作用。 方法：采用免疫組織化學ABC法檢測104例慢性淺表性胃炎、98例慢性萎縮性胃炎、112例胃黏膜腸上皮化生、106例胃黏膜不典型增生和93腸型胃癌組織中Cdx2及p21蛋白的表達

17、。 結(jié)果：Cdx2在慢性淺表性胃炎和慢性萎縮性胃炎組織中無表達，在胃黏膜腸上皮化生組織中的蛋白表達陽性率顯著高于胃黏膜不典型增生和腸型胃癌(P＜0.05)，陽性表達率分別為86.6％(97/112)、58.5％(62/106)和56.9％(53/93)。 p21在胃癌癌變多階段組織中均有表達，表達陽性率分別為92.3％(96/104)、89.8％(88/98)、58.0％(65/112)、52.8％(56/106)、46