cagA和cagL對(duì)幽門螺桿菌侵襲細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可以侵入胃黏膜上皮細(xì)胞并在胃上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖進(jìn)而參與致病作用。但幽門螺桿菌侵襲胃黏膜上皮細(xì)胞的機(jī)制尚不明確。研究已證實(shí)細(xì)胞的β1整合素可介導(dǎo)Hp侵入細(xì)胞，但尚不清楚細(xì)菌與侵襲相關(guān)的毒力因子。鑒于此，本研究將從已知幽門螺桿菌的CagA和CagL能與β1整合素結(jié)合為切入點(diǎn)，探究cagA和cagL兩基因?qū)p侵襲細(xì)胞功能的影響，旨在揭示與Hp侵襲細(xì)胞功能相關(guān)的毒力因子。

2、
　　方法：
　　1、幽門螺桿菌NCTC11637cagL缺失株的構(gòu)建
　　參考NCBI HpJ99全基因組序列，設(shè)計(jì)NCTC11637cagL同源臂，將卡那霉素抗性基因(kanaR)連接到PCR擴(kuò)增cagL基因兩端區(qū)域產(chǎn)生的兩個(gè)同源臂之間，而后插入pBluescript SKⅡ（-）載體中，構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的重組質(zhì)粒。運(yùn)用基因同源重組方法，將此重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到NCTC11637中，以卡那霉素抗性基因替換

3、cagL基因，通過卡那霉素羊血平板篩選出NCTC11637cagL缺失株，命名為NCTC11637ΔcagL，傳25代，經(jīng)尿素酶和PCR鑒定，以證實(shí)遺傳穩(wěn)定性。
　　2、AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞β1整合素表達(dá)驗(yàn)證
　　采用Trizol法提取兩株細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR獲得cDNA，以此為模板PCR，對(duì)β1整合素進(jìn)行mRNA水平表達(dá)驗(yàn)證；利用膜蛋白提取試劑盒提取兩株細(xì)胞總膜蛋白，用抗β1整合素抗體進(jìn)行wester

4、n blot對(duì)β1整合素進(jìn)行蛋白水平表達(dá)驗(yàn)證。
　　3、cagA和cagL對(duì)幽門螺桿菌侵襲AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞功能的影響
　　以NCTC11637、NCTC11637ΔcagL和NCTC11637ΔcagA（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存）感染AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞（MOI=50，MOI為細(xì)菌數(shù)和細(xì)胞數(shù)的比值），一部分細(xì)胞于感染2h后洗滌裂解，裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，此為粘附細(xì)胞細(xì)菌數(shù)；另一部分細(xì)胞

5、感染2h后，利用慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn)，2h后，裂解細(xì)胞，裂解物涂布細(xì)菌培養(yǎng)板，培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，此為侵入細(xì)胞菌數(shù)。通過計(jì)算侵襲粘附比反映cagA和cagL對(duì)幽門螺桿菌侵襲能力的影響，侵襲粘附比=（侵入細(xì)胞菌數(shù)/粘附細(xì)胞菌數(shù)）×100％。
　　4、cagA和cagL對(duì)幽門螺桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活時(shí)間的影響
　　以 NCTC11637、NCTC11637ΔcagL和NCTC11637ΔcagA感染 AGS細(xì)胞（MOI=50），利用

6、慶大霉素保護(hù)性侵襲實(shí)驗(yàn)，以含慶大霉素25μg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)，分別在24h，36h，48h，72h，96h終止實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、利用同源重組基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了幽門螺桿菌 NCTC11637 cagL缺失株NCTC11637ΔcagL；經(jīng)傳25代，尿素酶和PCR鑒定，證明缺失突變株穩(wěn)定；
　　2、AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞均可以表達(dá)β1整合素，相對(duì)灰度值結(jié)果表明，AGS

7、細(xì)胞β1整合素表達(dá)（6.387±2.957）高于SGC7901細(xì)胞（4.442±2.382）；
　　3、cagA和cagL對(duì)幽門螺桿菌侵襲AGS細(xì)胞與SGC7901細(xì)胞功能的影響
　　（1）NCTC11637對(duì)AGS細(xì)胞的侵襲作用（28.285±4.646%）強(qiáng)于SGC7901細(xì)胞（0.194±0.038%）；
　　（2）AGS細(xì)胞中，NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲

8、粘附比分別為28.285±4.646%、9.055±3.104%和9.225±0.417%，NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比均顯著低于 NCTC11637（P<0.05），NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL侵襲粘附比差異無(wú)顯著性；
　　（3）SGC7901細(xì)胞中，NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比分別為0.194±

9、0.038%、0.029±0.007%和0.061±0.009%，NCTC11637ΔcagA的侵襲粘附比顯著低于 NCTC11637（P<0.01），NCTC11637ΔcagL的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637（P<0.05）。
　　4、NCTC11637、NCTC11637ΔcagA和NCTC11637ΔcagL感染 AGS細(xì)胞后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)逐漸減少，NCTC11637ΔcagL在胞內(nèi)可存活72h，NC