重組表達(dá)幽門螺桿菌致病島CagL蛋白及其抗體阻斷粘附試驗(yàn).pdf

1、幽門螺桿菌(H.pylori.Hp)在全球的感染率超過50％，它是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，還與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。H.pylori侵入機(jī)體后能夠產(chǎn)生損傷胃粘膜的毒素，并誘發(fā)機(jī)體一系列炎癥、免疫反應(yīng)，這與其在胃粘膜定植生存有關(guān)。致病的H.pylori菌株含有一個(gè)約40kb的特殊基因片段，即cag致病島(cytotoxin associated gene pathogenicity isla

2、nd，cag PAI)，該基因序列呈高密度分布并編碼一個(gè)分泌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)稱為Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system，TFSS)。在H.pylori粘附定植的過程中，H.pylori致病因子是通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞的，在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中CagL蛋白的參與非常重要。它通過H.pylori菌毛與宿主接觸，導(dǎo)致黏著斑激酶(FAK)和Src家族激酶(Src farrulykinases，SFKs)的活化及酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)

3、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重新排列，細(xì)胞漿膜的動(dòng)態(tài)變化，整合素的聚集及其它受體的活化；同時(shí)活化的Src刺激下游信號(hào)系統(tǒng)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子如IL-8的合成和分泌。CagL的這些生物學(xué)行為對(duì)H.pylori致病因子進(jìn)入宿主的細(xì)胞和引發(fā)宿主細(xì)胞病理改變極為重要。因此，本研究擬對(duì)CagL基因進(jìn)行克隆表達(dá)，制備多克隆抗體進(jìn)行阻斷粘附試驗(yàn)，這將有助于進(jìn)一步明確CagL在H.pylori致病性及定植機(jī)制中的作用，并為研制H.pylori疫苗奠

4、定基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果： 1.重組幽門螺桿菌CagL蛋白的表達(dá)、純化 采用PCR方法以H.pylori(NCTC11639株)基因組DNA為模板，擴(kuò)增cagL基因片段并構(gòu)建在原核表達(dá)載體PET-22b(+)中，通過酶切、測(cè)序鑒定陽性重組子。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果顯示，幽門螺桿菌cagL基因被J下確克隆到PET-22b(+)中。 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件D

5、NAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對(duì)已公布的H.pylori基因序列進(jìn)行相似性分析。克隆cagL基因的核苷酸序列長(zhǎng)度為714bp，與GenBank中(11639)序列比較，基因相似性為IOO％。 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的蛋白表達(dá)率約為40％，超聲破菌后電泳鑒定目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。用AKTA-explore純化系統(tǒng)純化出CagL。用SDS-PAGE對(duì)純化產(chǎn)物分析表明CagL的純度>90％。Western

6、 blot結(jié)果顯示重組幽門螺桿菌CagL蛋白具有與抗H.pylori多克隆抗體血清的免疫反應(yīng)性； 2.制備兔抗CagL多克隆抗體血清及其鑒定 以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔，制備兔抗CagL多克隆抗體血清，雙擴(kuò)試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)鑒定其免疫性。ELISA檢測(cè)出多克隆血清的效價(jià)為1：16，000。經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)，多克隆血清效價(jià)為1:16。 3.兔抗CagL多克隆抗體血清對(duì)幽門螺桿菌粘附阻斷實(shí)驗(yàn)： 3

7、.1 CagL多克隆抗體血清對(duì)幽門螺桿菌粘附阻斷實(shí)驗(yàn) 將幽門螺桿菌接種于H.pylori選擇培養(yǎng)基中，在5％O2，85％ N2，10％ CO2，37℃條件下培養(yǎng)，24h后挑菌進(jìn)行形態(tài)及生化鑒定。將H.pylori培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm=0.6)。再將H.pylori和CagL多克隆抗體中和后加入貼壁生長(zhǎng)在蓋玻片上的Hela細(xì)胞中，37℃、5％CO2共同孵育4h，分別加入H.pylori和DH5α菌作為陽性對(duì)照及陰性對(duì)照

8、。姬姆薩染色結(jié)果顯示CagL多克隆抗體有阻斷幽門螺桿菌粘附定植Hela細(xì)胞能力。 3.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分析IL-8濃度 用3.1的操作方法，取細(xì)胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定分析IL-8濃度。 結(jié)果顯示：CagL多克隆抗體血清預(yù)先中和的H.pylori和未中和的H.pylori對(duì)照間有顯著性差異(p<0.05)，前者IL-8水平顯著低于后者。表明CagL多克隆抗體血清與H.pylori抗原充分結(jié)合后，可以減少H

9、.pylori促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-8的能力。 結(jié)論： 本研究成功構(gòu)建、表達(dá)、純化出的重組幽門螺桿菌CagL蛋白，具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。阻斷粘附實(shí)驗(yàn)說明制備的CagL多克隆抗體血清對(duì)阻斷H.pylori的粘附能力發(fā)揮了重要的作用。細(xì)胞因子IL-8的檢測(cè)表明CagL多克隆抗體血清可以減少H.pylori促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-8的能力。以上實(shí)驗(yàn)說明CagL蛋白在H.pylori定植并轉(zhuǎn)化CagA進(jìn)入細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-