幽門螺桿菌CagL蛋白的功能研究及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:
　　 研究幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)CagL蛋白在體外對人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)生理功能的影響。制備CagL蛋白單克隆抗體（mAb），并鑒定其特性。
　　 方法:
　　 1.用IPTG誘導(dǎo)含pET-28a(+)-cagL表達(dá)載體的E.coliBL21(DE3)菌表達(dá)CagL融合蛋白，之后用Ni2+-NTA親和層析法進(jìn)行純化;
　　 2.用不同濃度Ca

2、gL融合蛋白與GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)，運(yùn)用顯微鏡觀察其在不同時(shí)間段對細(xì)胞形態(tài)的影響;MTT法檢測其對細(xì)胞增殖的影響;
　　 3.收集不同時(shí)間、不同濃度CagL融合蛋白與GES-1共培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清，用液相芯片分析技術(shù)檢測培養(yǎng)上清中促炎細(xì)胞因子(IFNγ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-10,IL-12p70，IL-13，TNF-a)的分泌情況;
　　 4.用SPSSv19.0軟

3、件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;組間差異的比較采用多因素方差分析;
　　 5.用純化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠;利用細(xì)胞融合技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合獲得雜交瘤細(xì)胞;通過數(shù)輪亞克隆和間接ELISA篩選能穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞;
　　 6.腹腔接種陽性雜交瘤細(xì)胞于BALB/c小鼠，制備腹水型mAb，并進(jìn)行純化;
　　 7.用ELISA法鑒定mAb的免疫球蛋白類型;間接ELISA法測定

4、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、腹水的抗體效價(jià)及其相對親和力;相加ELISA法初步分析mAb識(shí)別表位的異同;間接ELISA法和Westernblot法鑒定mAb的反應(yīng)特異性。
　　 結(jié)果:
　　 1.純化的CagL融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，在預(yù)期的分子量32kDa處見特異目的條帶，融合蛋白的純度達(dá)到85％以上。
　　 2.不同濃度CagL融合蛋白與GES-1細(xì)胞作用不同時(shí)間后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞增殖能力隨蛋白濃

5、度的增加和作用時(shí)間的延長而降低。
　　 3.CagL融合蛋白能誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞分泌部分促炎細(xì)胞因子，如IL-8、IL-6、IL-7、IL-12、TNF-a。
　　 4.用CagL融合蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，血清多抗效價(jià)達(dá)1∶80000以上;經(jīng)融合及亞克隆后共獲得三株能穩(wěn)定分泌抗CagL蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為HPL-1C9、HPL-2G10、HPL-3E6。
　　 5.分別接種三株雜交瘤細(xì)胞于BA

6、LB/c小鼠，成功獲取腹水。
　　 6.獲得兩株IgM類和一株IgG2a類mAb;三株雜交瘤細(xì)胞上清的效價(jià)均在1∶64～1∶128之間;腹水效價(jià)在1∶16000以上相對親和力較高;三株mAb識(shí)別的抗原表位各不相同;Westernblot鑒定結(jié)果表明三株mAb均能特異性結(jié)合CagL融合蛋白，其中能特異性結(jié)合H.pylori全菌蛋白及膜組分蛋白的有兩株。
　　 結(jié)論:
　　 本研究結(jié)果顯示，H.pyloriCagL融