幽門螺桿菌iceA基因相關(guān)的致病機制.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種專寄生于人胃黏膜的革蘭陰性微需氧菌,世界上至少有50％人口感染H.pylori。許多研究表明,H.pylori感染后可導(dǎo)致胃炎和消化性潰瘍等疾病,而且是胃癌、初級B淋巴瘤、硬化性膽管炎等疾病的重要因素。H.pylori的感染和發(fā)病涉及多個毒力因子。H.pylori接觸胃粘膜上皮后可誘導(dǎo)表達一種毒力相關(guān)因子——粘膜接觸誘導(dǎo)因子,是獨立于cagA和vacA之外的一個

2、重要毒力相關(guān)基因,由iceA基因編碼,包括iceA1、iceA2兩種等位基因。該基因可能通過調(diào)控相關(guān)毒素基因的表達等機制,參與Hp的致病作用。有研究發(fā)現(xiàn),iceA基因與消化性潰瘍及IL-8的黏膜濃度增高顯著相關(guān),而IL-8在H.pylori所致相關(guān)性炎癥及疾病中發(fā)揮著重要作用。雖然國內(nèi)外研究人員針對iceA基因與H.pylori所致臨床疾病的相關(guān)性進行了大量研究,認為iceA基因(包括iceA1和iceA2基因)是慢性胃炎和十二指腸潰瘍

3、特異性相關(guān)基因,是一種與炎癥和免疫損傷有關(guān)的毒力因子。但是iceA基因生物學功能及其致病機制仍不十分清楚。
　　 研究首先利用鄭州市慢性萎縮性胃炎患者幽門螺桿菌臨床分離株MEL-H.pylori27,對iceA基因進行了克隆和序列分子特征分析;又根據(jù)同源重組原理,利用分子生物學方法進行了Hp27 iceA基因的插入失活突變,構(gòu)建了iceA基因的Hp27突變株;然后進一步比較遺傳背景相同的野生株和構(gòu)建的Hp27 iceA基因突變株

4、的重要特性,包括菌株的尿素酶活性、與細胞體外共培養(yǎng)時對胃粘膜上皮細胞的形態(tài)特征、細胞周期、增殖、凋亡等特性的影響;比較野生株和突變株對細胞的黏附性以及誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-8能力等炎癥相關(guān)因素。為闡明iceA基因的功能及參與Hp致病的分子機制奠定了重要的實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、幽門螺桿菌菌株的培養(yǎng)及基因組DNA的制備：將臨床分離株MEL-Hp27(Hp27)接種于布氏平板上,37℃微需氧條件下培養(yǎng)。3

5、d后收獲細菌,提取基因組DNA。
　　 2、Hp27 iceA基因的克隆
　　 2.1引物設(shè)計及PCR擴增：參照GenBank公布的H.pylori菌株的iceA基因及其上下游核苷酸序列設(shè)計引物,用于擴增包括iceA基因在內(nèi)的基因序列,擴增片段長度約790 bp。
　　 2.2 iceA基因克隆與測序：PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆,測序并分析。

6、>　　 2.3基因序列特征分析：從GenBank上檢索H.pylori菌株的iceA基因的同源基因序列,用Clustal W軟件對檢索到的基因序列進行多重序列比較,應(yīng)用MEGA4.0等軟件對基因及相應(yīng)氨基酸序列進行同源比較,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹進行分析。
　　 3、iteA基因打靶載體的構(gòu)建
　　 3.1將重組質(zhì)粒pMD19-T-iceA及質(zhì)粒pBluescript SKⅡ(一)分別酶切并連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS-iceA

7、。
　　 3.2將重組質(zhì)粒pBS-iceA和卡那霉素抗性基因擴增產(chǎn)物酶切并連接,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標記的突變打靶載體pBS-iceA-km。
　　 4、iceA基因突變株的構(gòu)建與鑒定：采用電穿孔方法將打靶載體pBS-iceA-km電轉(zhuǎn)化入受體菌株野生型Hp27中,在普通布氏平板上培養(yǎng)48h,然后轉(zhuǎn)涂于含卡那霉素布氏平板上繼續(xù)培養(yǎng)3～5d,篩選出iceA基因突變株,經(jīng)PCR及測序進行鑒定。
　　 5、野生株和ic

8、eA基因突變株特性比較
　　 5.1采用尿素酶活性診斷試劑,檢測和比較野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突變株的尿素酶活性差異。
　　 5.2將細菌與SGC7901細胞共同培養(yǎng)一定時間,觀察和比較細胞形態(tài)學變化。
　　 5.3采用MTT比色法,檢測野生株Hp27和Hp27 iceA插入失活突變株對SGC7901細胞增殖活性的影響并分析比較。
　　 5.4流式細胞儀檢測野生株、突變株與SGC7901

9、細胞共培養(yǎng)一定時間后細胞周期的改變并分析比較。
　　 5.5流式細胞儀檢測野生株、突變株與SGC7901細胞共培養(yǎng)一定時間后細胞的凋亡率并分析比較。
　　 6、iceA基因的炎癥相關(guān)因素研究
　　 6.1 Hp誘導(dǎo)SGC7901細胞分泌細胞因子IL-8的分析：H.pylori27野生株與突變株分別與細胞共培養(yǎng)一定時間,誘導(dǎo)細胞分泌IL-8。收集培養(yǎng)上清液,用ELISA試劑盒定量檢測IL-8的濃度并分析。
　

10、　 6.2 H.pylori27野生株與突變株對胃粘膜上皮細胞的黏附作用分析：野生株與突變株分別與細胞共培養(yǎng)一定時間,用免疫學方法處理,在熒光倒置顯微鏡下觀察,流式細胞儀檢測并分析其粘附率。
　　 7、統(tǒng)計學分析處理：應(yīng)用SPSS11.0軟件分析各指標數(shù)據(jù),計量資料以-x±S表示,兩組之間的比較采用t檢驗;多組之間的比較,根據(jù)資料特點分別采用單因素方差分析或重復(fù)測量的方差分析;兩兩比較采用最小顯著差法(LSD),檢驗水準取a=

11、0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1、幽門螺桿菌分離株MEL-Hp27 iceA基因克隆及分析
　　 成功克隆幽門螺桿菌Hp27菌株iceA基因序列,擴增產(chǎn)物大小約為790 bp;重組質(zhì)粒pMD19-T-iceA單酶切產(chǎn)生3820 bp片段,雙酶切產(chǎn)生3000 bp和820 bp的2個片段;Hp27 iceA基因與大多數(shù)美國來源菌株同源性較高,均大于85％,與日本、印度等地區(qū)來源菌株同源性小于70％;Hp27 ic

12、eA基因-1O區(qū)(TATA)位于起始密碼子ATG上游的17bp處,起始密碼子上游-7nt處有一個SD序列,起始密碼子和上游cysE基因之間有兩個8bp的串聯(lián)可重復(fù)序列,其它地區(qū)分離菌株與Hp27 iceA基因特征有差異。
　　 2、MEL-Hp27 iceA基因突變株的構(gòu)建
　　 采用基因重組的方法將卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中,構(gòu)建了突變打靶載體pBS-iceA-km;通過電穿孔轉(zhuǎn)化方法將突變載體轉(zhuǎn)化進入野生株,

13、篩選出iceA基因突變株。用iceA基因兩端序列設(shè)計引物分別擴增突變株和野生株的基因組DNA,結(jié)果突變株的擴增片段長度比野生株長約800bp,且突變株能擴增出卡那霉素抗性基因片段,野生株則不能。擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果證明卡那霉素抗性基因插入目的基因序列中。
　　 3、野生株和iceA基因突變株尿素酶活性比較
　　 將構(gòu)建的突變株和野生株分別與尿素酶試劑作用,立即引起明顯的顏色改變,野生株25min完全分解尿素酶試劑達到其最大

14、吸光度值,且在此之前其吸光度值均高于突變株組。突變株組在50 min達到其最大吸光度值,且在作用25min后的吸光度值均高于野生株組,但兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4、iceA基因?qū)GC7901細胞生長的影響
　　 H.pylori突變株組和野生株組引起相似的細胞形態(tài)學改變,細胞拉伸,出現(xiàn)蜂鳥樣改變;細菌和細胞共培養(yǎng)12h和18h,與對照組相比細胞活力輕度增加。共培養(yǎng)24h后,與對照組相比細胞活力則下降。在細菌

15、與細胞共培養(yǎng)12h、18h、24h,野生株組和突變株組細胞增殖活性與空白組相比,差異無統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)30h和36h各組細胞的增殖活性差異有統(tǒng)計學意義,其中,培養(yǎng)30h時突變株組的細胞增殖活性高于野生株組;與對照組相比,野生株對細胞周期的影響主要表現(xiàn)為G2期的阻滯;而突變株對細胞周期的影響主要表現(xiàn)為S期的阻滯;野生株組和突變株組均可以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生明顯凋亡,共培養(yǎng)24h及48h的凋亡率均高于對照組凋亡率,但野生株組和突變株組之間凋亡率的差

16、異無統(tǒng)計學意義。
　　 5、iceA基因的炎癥相關(guān)因素研究
　　 將H.pylori分別與SGC7901細胞共培養(yǎng)8h和24h后,檢測誘導(dǎo)IL-8的濃度,野生株組和突變株組與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義。共培養(yǎng)8h野生株組和突變株組之間,差異無統(tǒng)計學意義,但共培養(yǎng)24h后,野生株組和突變株組間差異有統(tǒng)計學意義;熒光顯微鏡下顯示野生株和突變株均迅速粘附在SGC7901細胞表面,野生株和突變株的粘附率分別為32.49±2.9

17、6％和25.03±2.74％,但二組間差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、來自不同地區(qū)的幽門螺桿菌分離菌株iceA基因序列的分子特征有差異。
　　 2、Hp27菌株和Hp27 iceA基因突變株可以抑制SGC7901細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡:iceA基因的插入失活突變明顯改變細胞增殖和細胞周期特征,對細胞凋亡率和粘附率的影響無統(tǒng)計學意義。
　　 3、Hp27菌株和Hp27 iceA基因突變株均可以誘