幽門(mén)螺桿菌dupA基因功能的研究.pdf

1、目的:
　　DupA蛋白是近幾年新發(fā)現(xiàn)的H.pylori毒力因子，由dupA基因編碼。DupA蛋白可以升高十二指腸潰瘍發(fā)病率，降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但該結(jié)論存在爭(zhēng)議。目前國(guó)內(nèi)外缺乏對(duì)dupA基因功能及其編碼蛋白DupA致病機(jī)制的研究報(bào)道。
　　本文以H.pylori的dupA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，使用生物信息學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)探討dupA基因的功能及其編碼蛋白DupA致病機(jī)制，為深入研究H.pylori的致病機(jī)制

2、奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用PCR擴(kuò)增的方法分離H.pylori WH-21菌株攜帶的dupA基因，獲得目的基因片段并測(cè)序。使用生物信息學(xué)軟件:ProtParam、ANTHEPROT5.0、SignalP4.1 server、PSORTb3.0.2對(duì)其基本的理化性質(zhì)、信號(hào)肽和細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;用NPSA_server在線軟件預(yù)測(cè)分析DupA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);用Phyre2.0進(jìn)行DupA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)配體的預(yù)測(cè)。

3、r>　　2.構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a-dupA，使用誘導(dǎo)劑(IPTG)在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白;蛋白純化后用Western blot法進(jìn)行鑒定。
　　3.用純化好的融合蛋白制備兔抗DupA多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定抗體效價(jià)。
　　4.利用同源重組原理，構(gòu)建dupA基因缺失自殺質(zhì)粒pBlueKM40-ΔdupA∷kan，電擊轉(zhuǎn)入感受

4、態(tài)WH-21中，抗性篩選出陽(yáng)性克隆，PCR驗(yàn)證，獲得dupA基因缺失株。
　　5.收集并裂解WH-21細(xì)菌菌體，用超高速低溫離心法獲得不同的亞細(xì)胞組分，一抗使用上述制備的多克隆抗體，Western blot檢測(cè)DupA蛋白亞細(xì)胞定位。
　　6.胃上皮細(xì)胞GES-1與dupA基因缺失株和野生株WH-21共培養(yǎng)，使用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的CagA蛋白含量，研究dupA基因缺失對(duì)Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白的影響。

5、r>　　7.采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析方法，進(jìn)行DupA蛋白的互作蛋白分析。
　　結(jié)果:
　　1.H.pylori WH-21菌株dupA基因全長(zhǎng)為2499bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為832aa，相對(duì)分子質(zhì)量為96.30kDa，等電點(diǎn)為8.46，屬于穩(wěn)定蛋白，親水性強(qiáng);存在多個(gè)跨膜區(qū)且沒(méi)有信號(hào)肽存在;細(xì)胞定位預(yù)測(cè)提示DupA蛋白定位在胞膜;α螺旋是DupA蛋白多肽鏈中主要的組成結(jié)構(gòu)元件;配體結(jié)合位點(diǎn)分析表明，DupA蛋白結(jié)合位點(diǎn)的

6、物質(zhì)為ADP、ATP和Mg2+并且與CagE_TrbE_VirB超家族有較高的同源性。
　　2.構(gòu)建成功原核表達(dá)載體pET-32a-dupA，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)及QIAGEN系統(tǒng)純化后獲得目的蛋白。
　　3.免疫家兔獲得了兔抗DupA多克隆抗體，效價(jià)為1∶6.4×104。
　　4.構(gòu)建成功dupA基因敲除重組自殺質(zhì)粒pBlueKM40-ΔdupA∷kan。電轉(zhuǎn)化自殺質(zhì)粒進(jìn)入H.pylori WH-21菌體內(nèi)，通過(guò)卡那霉素

7、抗性篩選及PCR驗(yàn)證得到H.pylori dupA基因缺失株即ΔdupA。
　　5.以兔抗DupA多克隆抗體為一抗作Western blot分析，確定DupA蛋白定位于胞膜。
　　6.H.pylori與GES-1做共培養(yǎng)，檢測(cè)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)量，結(jié)果顯示dupA基因缺失株和野生株向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白無(wú)差別。
　　7.經(jīng)過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析，DupA蛋白的互作蛋白為脲酶和HSP60。
　　結(jié)論:
　　

8、1.成功克隆了dupA全長(zhǎng)基因，并完成測(cè)序，使用生物信息學(xué)方法了解了其編碼蛋白的基本特性，包括該蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特征及該蛋白細(xì)胞定位和功能結(jié)構(gòu)域等。
　　2.成功構(gòu)建了dupA基因的原核表達(dá)載體pET-32a-dupA，經(jīng)誘導(dǎo)純化獲得目的蛋白，免疫家兔后獲得兔抗DupA多克隆抗體。
　　3.成功構(gòu)建了dupA基因敲除重組自殺質(zhì)粒并通過(guò)篩選獲得了一株dupA基因缺失株即AdupA。
　　4.DupA蛋白可