胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)幽門螺桿菌毒力分析及dupA(2499)基因功能研究.pdf

1、目的:
　　幽門螺桿菌（H.pylori)是定植于人類胃粘膜上皮細(xì)胞表面的一種細(xì)菌，與胃十二指腸疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。分析胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）H.pylori臨床分離株毒力因子的分子特征（包括cagPAI、vacA基因和dupA基因），以評(píng)價(jià)該地區(qū)H.pylori臨床分離株的毒力。研究該地區(qū)H.pylori菌株的dupA基因功能，以探討H.pyloridupA基因的致病機(jī)制。
　　方法:
　　1.選取胃十二

2、指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）臨床就診的患者，進(jìn)行胃粘膜組織分離培養(yǎng)H.pylori菌株。采用PCR擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序的方法，分析H.pylori臨床分離株cagPAI（cagA，cagE,cagI,cagL,cagM,cagT和cagX基因）、cagA基因3'端可變區(qū)、vacA基因和dupA基因類型，與NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation)中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)。并根據(jù)基因序列獲得了相應(yīng)蛋白的氨基酸

3、序列，采用MEGA4.1構(gòu)建相應(yīng)系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　2.研究分離于十二指腸潰瘍患者的H.pyloriWH-21菌株攜帶的dupA基因類型，并對(duì)其蛋白進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析，包括該蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)特征及該蛋白細(xì)胞定位和功能結(jié)構(gòu)域等。
　　3.構(gòu)建pET-32a-dupA原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化于E.coliRosetta(DE3)中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)重組DupA蛋白，以Ni2+-NTA珠分離純化目的蛋白。利用ATPa

4、se分解ATP生成無機(jī)磷的原理，檢測(cè)重組DupA蛋白的ATPase活性。采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制備抗重組DupA蛋白多克隆抗血清。
　　4.利用Westernblotting法檢測(cè)DupA(2499)蛋白的亞細(xì)胞定位。采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析方法，進(jìn)行DupA(2499)蛋白的互作蛋白分析。
　　5.構(gòu)建敲除載體pBluescript/△dupA∷KMr，采用同源重組的方法構(gòu)建H.pyloridupA(2499)基因缺失株。

5、>　　6.H.pylori和GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，采用Westernblotting方法分析dupA(2499)基因的缺失對(duì)H.pyloriCagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，以及CFU實(shí)驗(yàn)和粘附率實(shí)驗(yàn)分析H.pyloridupA(2499)基因缺失株的粘附功能。
　　7.分析不同pH值液體培養(yǎng)基中H.pylori生長(zhǎng)情況，研究H.pyloridupA(2499)基因缺失株對(duì)酸性環(huán)境的抵抗力。采用Westernblotting，分析培養(yǎng)后上

6、清液中脲酶含量。H.pylori和GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)，采用ELISA方法分析上清液中IL-8的濃度，分析H.pyloridupA(2499)基因缺失株毒力變化。
　　8.H.pylori和MKN-45細(xì)胞共培養(yǎng)后，采用MTT方法檢測(cè)H.pyloridupA(2499)基因缺失株的細(xì)胞毒變化，Hoechst33258染色后顯微鏡下觀察H.pyloridupA(2499)基因缺失株對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化的影響，Westernblotti

7、ng分析線粒體通路的凋亡相關(guān)分子標(biāo)志變化，包括活化Caspase-3，PARP，Bax和Bcl-2變化。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，116株H.pylori臨床分離株均攜帶cagA，cagL，cagM,cagT和cagX基因，而只有89.7％(104/116)和82.8％(96/116)菌株分別擴(kuò)增出cagE和cagI基因。25.9％(30/116)菌株中發(fā)現(xiàn)cagPAI部分缺失，其中cagPAI部分缺失株在慢性

8、胃炎中占44.4％(24/54)顯著高于胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌(9.7％，6/62)(p＜0.001)。未發(fā)現(xiàn)cagPAI完全缺失的H.pylori菌株。
　　24株菌株cagA3'端可變區(qū)氨基酸序列可分為兩大群:東亞型(91.7％)和西方型(8.3％)，其中前者為EPIYA-A-B-D型，后者為EPIYA-A-B-C型。CagPAI蛋白中除了CagL蛋白外，CagI、CagM、CagT和CagX蛋白序列均為保守。系統(tǒng)發(fā)育樹提

9、示CagPAI蛋白也分為兩個(gè)群:東亞型和西方型，大部分菌株也屬于東亞型。
　　H.pylori臨床分離株vacA基因s區(qū)和m區(qū)的主要流行模式為s1a/m2(48.3％)和s1c/m2(13.8％)。31.0％的H.pylori臨床分離株攜帶dupA基因，其中在胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌攜帶率為40.3％，高于慢性胃炎(20.4％，p=0.02)。dupA基因序列分析顯示其讀碼框架為2499bp，稱作dupA(2499)基因。

10、>　　2.H.pyloriWH-21菌株攜帶的dupA基因全長(zhǎng)2499bp，稱作dupA(2499)基因。威海地區(qū)8株dupA堿基序列同源性為99.3％，與日本兩株H.pylori菌株的dupA基因堿基序列同源性為99.25％，不同地區(qū)14株H.pyloridupA堿基序列同源性為91.65％。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DupA(2499)蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，抗原性強(qiáng)。無信號(hào)肽且有多個(gè)跨膜區(qū)，定位于細(xì)胞內(nèi)膜。α螺旋是該蛋白多肽鏈中主要組成結(jié)

11、構(gòu)元件，具有一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其配體結(jié)合物質(zhì)為ADP、ATP和Mg2+等。與CagE_TrbE_VirB超家族有較高的同源性，具有ATP結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.獲得了重組DupA蛋白，該蛋白ATPase活力為129.5±17.8U/mgprot。成功制備了抗重組DupA蛋白多克隆抗血清，抗體效價(jià)為1∶6.4×104。
　　4.Westernblotting結(jié)果顯示DupA(2499)蛋白定位于胞膜。經(jīng)過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

12、和質(zhì)譜分析，DupA(2499)蛋白的互作蛋白為脲酶和HSP60。
　　5.獲得了H.pyloridupA(2499)基因缺失株，并通過了PCR和Westernblotting的驗(yàn)證。
　　6.采用H.pylori感染GES-1細(xì)胞后，缺失株組和野生株組向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白無差別。CFU實(shí)驗(yàn)結(jié)果[（27.2±7.1）×106和(28.5±6.9)×106，p=0.772]和粘附率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（81.0％和78.8％，p=0.7

13、24）均無明顯差異。
　　7.除pH6.5～pH7.5之外，其它酸性環(huán)境下野生株組菌量顯著高于缺失株組(p＜0.05)。缺失株組的脲酶分泌低于野生株組，特別在酸性環(huán)境時(shí)。細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)后，野生株組上清液中IL-8濃度顯著高于缺失株組(p＜0.001)。
　　8.與對(duì)照組比較，細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)12h后MKN-45細(xì)胞存活率開始降低，缺失株組MKN-45細(xì)胞存活率顯著高于野生株組(p＜0.05)。細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，Hoech

14、st33258染色結(jié)果顯示缺失株組和野生株組均可以引起MKN-45細(xì)胞凋亡，但野生株組凋亡率顯著高于缺失株組(p＜0.05)。6h后野生株組和缺失株組均開始出現(xiàn)Caspase-3和PARP的剪切活化，野生株組強(qiáng)于缺失株組。與缺失株組比較，野生株組Bax明顯上調(diào)而Bcl-2則明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）H.pylori臨床分離株為強(qiáng)毒株，與該地區(qū)的胃十二指腸疾病高發(fā)相關(guān)。H.pylori強(qiáng)毒性特

15、征與東亞型cagA基因3'端可變區(qū)、完整的cagPAI、東亞型cagPAI基因、強(qiáng)毒性vacA基因和dupA(2499)基因有關(guān)。
　　2.dupA(2499)基因保守且同源性高，適宜進(jìn)行體外表達(dá)。DupA(2499)蛋白穩(wěn)定且抗原性強(qiáng)，適合抗體的制備。
　　3.DupA(2499)蛋白獨(dú)立于CagPAI之外，存在于H.pylori的內(nèi)膜，具有ATPase活性并參與脲酶的分泌，但不參與H.pylori的CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和其