幽門螺桿菌可塑區(qū)hp4565基因的克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、目的:
　　Tfs3基因簇目前認(rèn)為是幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretion system，T4SS)編碼基因簇之一，位于幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)塑性區(qū)，但其在H.pylori中的作用尚不清楚。hp4565基因（與virB11同源）是tfs3結(jié)構(gòu)基因之一，其生物學(xué)特性在目前查的文獻(xiàn)還未見(jiàn)報(bào)道。為此，本論文以H.pylori塑性區(qū)hp4565基因作為研究對(duì)象，將其克隆表達(dá)出H

2、P4565重組蛋白，并制備了抗HP4565蛋白抗體，初步研究了重組HP4565蛋白的理化特性和功能，旨在尋找hp4565基因在tfs3結(jié)構(gòu)中的作用，為進(jìn)一步研究hp4565基因的功能和H.pylori的致病機(jī)制，以及為H.pylori感染的診斷治療等奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.根據(jù)基因庫(kù)中H.pylori Shfi470的hp4565的全基因組序列設(shè)計(jì)h4565基因的PCR引物，以H.pylori臨床株為模板，擴(kuò)增hp4

3、565基因。
　　2.T-A克隆后經(jīng)pET-30原核表達(dá)系統(tǒng)獲得大量HP4565融合蛋白。經(jīng)Ni2+-NTA柱純化蛋白，蛋白復(fù)性使用尿素梯度透析法。
　　4.將純化HP4565蛋白免疫白兔獲取抗血清并檢測(cè)抗體效價(jià)。
　　5.定磷法檢測(cè)HP4565蛋白ATP酶活力
　　6.MTT法檢測(cè)HP4565蛋白對(duì)胃上皮細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功克隆了幽門螺桿菌臨床株中hp4565基因，hp4565

4、基因全長(zhǎng)942bp，編碼313個(gè)氨基酸，與幽門螺桿菌菌株G27、J99、 Cuz20、Shfi470序列的核苷酸同源性為98％～100％。
　　2.工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，電泳顯示有41kDa的融合蛋白，經(jīng)Western blot鑒定是HP4565目的蛋白。純化復(fù)性后，HP4565蛋白濃度、純度較高。
　　3.免疫白兔獲得了效價(jià)為1∶1.6×105的抗血清。
　　4.純化后的重組蛋白作用胃上皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)在低濃度(≤4

5、0μg/ml)時(shí)，每一時(shí)段各濃度間無(wú)顯著差異;蛋白濃度在60μg/ml以上，培養(yǎng)6小時(shí)，濃度間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，當(dāng)培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞增殖率和低濃度相比顯著減低(P＜0.05)。
　　5.HP4565重組蛋白ATP酶活力為92.4U×mg prot-1×hour-1。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆、表達(dá)了臨床株中塑性區(qū)的hp4565基因。
　　2.得到純度和濃度較高的HP4565蛋白。
　　3.獲