幽門螺桿菌轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄口服疫苗的初步研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是造成胃腸道疾病如慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌的直接原因。本研究通過構(gòu)建融合表達載體,優(yōu)化櫻桃番茄(Lycopersivon esculentum Mill.)‘黃櫻桃-2號’再生培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將融合基因轉(zhuǎn)入櫻桃番茄子葉中,以期為生產(chǎn)幽門螺桿菌轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄口服疫苗打下基礎(chǔ)。
　　構(gòu)建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及

2、CHE8-UreB-eLTB融合表達載體,并優(yōu)化抗原表達策略。通過觀察不同激素配比下櫻桃番茄子葉愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)以及生根情況對櫻桃番茄再生體系進行優(yōu)化。通過篩選最適的農(nóng)桿菌侵染濃度、卡那霉素篩選濃度以及頭孢霉素、羧芐青霉素除菌濃度對櫻桃番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化。在獲得PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株后,利用real-time PCR(qPCR)對櫻桃番茄基因組中外源基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)以及幽門螺桿

3、菌粘附素基因(hpaA)的整合拷貝數(shù)進行探究。利用 RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄果實中外源基因的表達情況。提取櫻桃番茄果實的可溶性總蛋白,SDS-PAGE檢測外源蛋白表達情況。最后通過TTC染色對非轉(zhuǎn)基因植株、CHE8-2391Z轉(zhuǎn)基因植株以及 CHE8-HpaA-eLTB轉(zhuǎn)基因植株進行花粉活力對比,初步探究轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄坐果率低的原因。具體結(jié)果如下:
　　1.成功構(gòu)建CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB

4、以及 CHE8-UreB-eLTB表達載體。
　　2.分別獲得 CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及 CHE8-UreB-eLTB轉(zhuǎn)化植株23、21以及3株。
　　3.櫻桃番茄子葉愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為:MS+2.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L IAA,出愈率和出芽率分別達到100％和96.83%。最適生根培養(yǎng)基為:1/2 MS+0.2 mg/L IAA。
　　4.農(nóng)桿菌侵染濃度為O

5、D600≈0.4時,櫻桃番茄子葉的抗性愈傷率最高。確定卡那霉素篩選濃度為50 mg/L,頭孢霉素和羧芐青霉素除菌濃度均為200 mg/L。
　　5.經(jīng) PCR檢測呈陽性的CHE8-2391Z、CHE8-HpaA-eLTB以及 CHE8-UreB-eLTB轉(zhuǎn)基因植株分別有8、4以及0株。其中,在CHE8-HpaA-eLTB轉(zhuǎn)基因植株果實中檢測到外源基因轉(zhuǎn)錄水平的表達。
　　6.real-time PCR結(jié)果表明,外源基因在轉(zhuǎn)基

6、因植株內(nèi)整合的拷貝數(shù)為0-20不等,4株為PCR假陽性。80%的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了基因重排現(xiàn)象。
　　7.轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株的花粉活力存在差異,非轉(zhuǎn)基因植株、CHE8-2391Z轉(zhuǎn)基因植株以及 CHE8-HpaA-eLTB轉(zhuǎn)基因植株的花粉活力分別為:31%、4%和45.45%。
　　本研究優(yōu)化了櫻桃番茄‘黃櫻桃-2號’的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系,這為進一步挖掘櫻桃番茄作為轉(zhuǎn)基因植物受體材料的巨大潛力提供基礎(chǔ)。而得到的CHE8-