重組幽門螺桿菌口服脂質(zhì)體疫苗的制備及其免疫保護(hù)作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、該研究的目的是:選擇Hp尿素酶B亞單位(UreB)和過氧化氫酶(Kat)為靶抗原,應(yīng)用基因工程技術(shù)分別構(gòu)建重組UreB(rUreB)和重組Kat(rKat)原核表達(dá)體系,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)(FPLC)純化后,逆向蒸發(fā)法制備重組蛋白的脂質(zhì)體疫苗,并在BALB/c小鼠模型中評(píng)價(jià)其對(duì)Hp感染的免疫保護(hù)作用,并對(duì)其免疫保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討.方法:1.運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp總DNA中擴(kuò)增出UreB結(jié)構(gòu)基因,裝入pT(pGEM-T-easy

2、 vector)載體進(jìn)行序列分析,將UreB基因亞克隆入表達(dá)載體pET-22b(+)并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)Sephacyl S-200凝膠過濾和Sepharose Fast Flow陰離交換兩步層析獲得純化rUreB,免疫印跡法檢測(cè)抗原性.2.運(yùn)用PCR技術(shù)從Hp總DNA中擴(kuò)增出Kat結(jié)構(gòu)基因,裝入pET-22b(+)載體進(jìn)行序列分析,并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),貝爾斯-西策爾斯(Beers

3、& Sizers)法測(cè)定重組過氧化氫酶活性,表達(dá)Kat包涵體經(jīng)分離、洗滌、溶解、復(fù)性,采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)Sepharose Fast Flow陰離了交換、Octyl-Sepharose-4FF疏水層析、Sephacyl S-200凝膠過濾層析獲得純化的rKat.3.用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋白和有/無免疫佐劑的口服疫苗,并用透射電鏡測(cè)定其粒徑.結(jié)論:1.應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建分別pET-22b(+)/UreB和p

4、ET-22b(+)/Kat重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)快速蛋白質(zhì)液相色譜系統(tǒng)(FPLC)純化后,獲得了純化的重組蛋白,為Hp疫苗的研制提供了物質(zhì)基礎(chǔ);2.首次用逆向蒸發(fā)法制備以卵磷脂和膽固醇為膜組分包裹的重組蛋白口服疫苗,并在BALB/c小鼠Hp感染模型中證實(shí)了脂質(zhì)體能代替霍亂毒素的黏膜免疫佐劑作用;3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Hp疫苗能降低Hp在小鼠胃內(nèi)的定植密度,同時(shí)能減輕胃黏膜炎癥反應(yīng)程度,雙價(jià)疫苗較單價(jià)疫苗免疫保護(hù)作用更強(qiáng);4.