幽門螺桿菌Lpp20核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫活性的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建幽門螺桿菌脂蛋白Lpp20基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/Lpp20，并在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。通過肌肉注射免疫C57BL/6小鼠，觀察其所產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為研制高效、新型的幽門螺桿菌核酸疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：用PRIMER5.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增Lpp20全基因；將PCR產(chǎn)物純化后插入pGEX-6P-2載體，將重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/Lpp20轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21（DE

2、3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化重組蛋白并分析其免疫反應(yīng)性。再將Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建pcDNA3.1(+)/Lpp20重組體，并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)及Western-blot觀察鑒定其在真核細(xì)胞得到表達(dá)后，將核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20、對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)及PBS分組通過肌肉注射免疫6w齡C57BL/6小鼠，隔兩周免疫一次，共免疫四次。 ELISA間接法測(cè)定小鼠血清

3、中抗Lpp20 IgG抗體水平，ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平，MTT比色法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。通過PCR法檢測(cè)小鼠肌細(xì)胞中Lpp20基因的存在。 結(jié)果：成功克隆了Lpp20基因，并將其成功構(gòu)建到了pGEX-6P-2原核表達(dá)載體上，SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導(dǎo)下，重組工程菌表達(dá)了一相對(duì)分子量（Mr）約為44 Kda的目的蛋白條帶, Western-blot檢測(cè)顯示重組蛋白有良好的免疫

4、反應(yīng)性。成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/Lpp20真核表達(dá)載體，且重組質(zhì)粒能在HeLa細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)目的蛋白。小鼠接種pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能產(chǎn)生特異性IgG抗體，6w后ELISA測(cè)定血清抗體A450值為0.74，效價(jià)為1:1024。核酸疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后，培養(yǎng)上清中IFN-γ含量明顯升高(410.36±56.23pg/mL)，與空質(zhì)粒組(25.26±10.85pg/mL)之間有顯著性差異

5、(P<0.01)。脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)測(cè)定，核酸疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后，刺激指數(shù)(2.37±0.22)明顯高于空質(zhì)粒組(1.53±0.47)和PBS組(1.20±0.13)(P<0.01)。PCR檢測(cè)Lpp20基因可在小鼠肌細(xì)胞中存在。 結(jié)論： (1) 成功克隆了幽門螺桿菌 Lpp20基因，并構(gòu)建了pGEX-6P-2/Lpp20原核表達(dá)載體，且其可在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有良好免疫反應(yīng)性的重組蛋白。 (2