治療性幽門螺桿菌表位疫苗的實驗研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的主要病原菌，與胃癌、胃粘膜相關性淋巴組織淋巴瘤密切相關，已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子。目前臨床治療H.pylori感染主要方法為聯(lián)合應用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素的療法，雖然在一定程度上能清除H.pylori，但患者對藥物的依從性差、抗生素耐藥菌株不斷出現(xiàn)、再感染的發(fā)生及藥物的不良反應等，這都使臨床藥物治療受到限制。有效的預防性和治療性H.p

2、ylori疫苗可以克服上述藥物治療H.pylori的不足，被認為是控制H.pylori感染的最有前景的方法，是根除H.pylori感染的希望。 基于表位疫苗設計(Epitope-based Vaccine Design，EBVD)的策略被認為是第四代疫苗，其著眼點是免疫應答的功能單位——表位。表位疫苗明顯的優(yōu)勢是設計靈活、針對性強，選擇優(yōu)勢表位進行合理的組合設計，能夠誘導高效、安全、特異的免疫應答。近年來，表位疫苗已經(jīng)成為研制感

3、染性疾病、惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗設計的新方向，并取得顯著進展。H．pylori自然感染可通過免疫偏差、免疫顛覆和免疫缺陷等機制逃避機體的清除，進而引起機體對H．pylori自身天然蛋白成分的免疫耐受，研究表明僅僅選用H．pylori天然抗原進行免疫治療是很難打破機體免疫耐受，激發(fā)有效的免疫應答，因此，必須對天然抗原分子進行設計、修飾和改造。蛋白抗原發(fā)揮其功能主要通過表位來體現(xiàn)特異性，這些表位不僅包括B細胞表位、Th細胞表位、C

4、TL表位等與免疫識別相關的結(jié)構(gòu)，而且還同時存在毒性或抑制性表位等不利于免疫保護的因素。為了提高蛋白抗原的保護性，就必須在表位水平上作出選擇和設計以得到理想的疫苗分子。借鑒其它疾病表位疫苗的設計經(jīng)驗，選擇H．pylori優(yōu)勢抗原的保護性、特異性、免疫原性強的表位進行設計，輔以粘膜佐劑來激發(fā)更強、更特異的、不同于自然感染時的粘膜免疫應答，有可能打破免疫耐受，達到預防或治療H．pylori感染的目的。 H．pylori感染免疫治療后的

5、保護機制較為復雜，所設計的不同類型H．pylori治療疫苗的免疫應答機制也存在差異。在細胞免疫方面，已有很好的證據(jù)證實：CD4<'+>T細胞對于H．pylori的免疫保護是必需的，并且，隨著對H．pylori疫苗治療效果及機制研究的深入，逐漸認識到機體抵抗H．pylori感染的保護性機制可能為一種Th1/Th2同時存在的平衡應答模式；在體液免疫方面，不能完全排除特異性體液免疫應答的作用，基于對H．pylori感染免疫機制的進一步認識和本

6、室先前H．pylori感染治療的動物試驗結(jié)果，H．pylori治療性疫苗的設計可能遵循以CD4<'+>T細胞介導的Th1/Th2平衡應答為主，兼顧特異性體液免疫的基本策略。 在H．Pyfori的已知蛋白抗原中，尿素酶B亞單位(UreB)和粘附素(HpaA)是已經(jīng)證實具有很強的抗原性和免疫保護力的抗原。本課題在本室成功篩選和鑒定UreB多個Th細胞表位的基礎上，選用UreB三個優(yōu)勢性Th細胞表位(兩個Th2，一個Th1表位)和文獻

7、報道UreB的一個B細胞表位、HpaA的一個B細胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB，通過計算機輔助設計和分析對天然抗原表位進行分子設計、重組、優(yōu)化、計算機分子結(jié)構(gòu)模建等獲得理論上最佳組合方式，按此組合方式構(gòu)建了表達H．Pylori五個表位多肽基IN(Huepi)與ltB基因的表位疫苗融合蛋白，經(jīng)抗原特性及各表位功能分析后，進行口服免疫治療小鼠H．Pylori感染的試驗，觀察H．Pylori清除效果及相應的免疫應答過程，為H．Pylori治療性疫

8、苗的設計與完善奠定基礎。本課題的主要研究方法、結(jié)果與結(jié)論如下： 1．治療性幽門螺桿菌表位疫苗的設計 選用ureB三個優(yōu)勢性Th細胞表位(兩個Th2，一個Th1表位)和文獻報道UreB的一個B細胞表位、HpaA的一個B細胞表位以及分子內(nèi)佐劑LTB，利用RANKPEP軟件、DNAstar軟件進行表位組合順序分析和串聯(lián)表位與分子內(nèi)佐劑LTB之間連接linker的設計，獲得理論上最佳組合方式，采用Robetta、Modeller

9、和SPDB viewer軟件進行表位融合蛋白三級結(jié)構(gòu)的模建，獲得理論上最接近天然狀態(tài)下的三級結(jié)構(gòu)。 2．治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原的構(gòu)建、表達、純化 按照第一部分的設計，在本室成功構(gòu)建表位融合蛋白Uepi的基礎上，分別克隆了表位多肽基因Huepi和，ltB基因，采用重疊延伸PCR的方法將兩段基因按照預先設計的方向通過linker連接起來，獲得表位多肽與ItB的融合基因(Huepi-ltB)，通過限制性內(nèi)切酶Nc

10、oⅠ、XhoⅠ分別構(gòu)建原核表達載體pET22b-Huepi-ltB、pET22b-Huepi和原核表達工程菌株pET22b-Huepi-ltB/BL21、pET22b-Huepi/BL21，經(jīng)IPTG誘導高效表達分子量分別為20.7 kDa(Huepi-LTB)和8.3 kDa(Huepi)的表位融合蛋白，分別采用不同的純化方案對重組表位融合蛋白Huepi-LTB和Huepi進行純化與鑒定，純化后Huepi-LTB和Huepi的蛋白純度

11、分別為95.2％和97.6％。 3．治療性幽門螺桿菌表位疫苗融合蛋白抗原特性及各表位功能分析 表位疫苗融合蛋白分別免疫家兔制備兔抗Huepi-LTB和Huepi抗血清，采用Western blot和ELIsA檢測表位疫苗融合蛋白特異性抗體與rUreB和rHpaA的免疫反應性及LTB組分GM1神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合活性；通過尿素酶抑制實驗、H.Pylori與胃上皮細胞(GES-1)的粘附與粘附抑制實驗，血凝與血凝抑制實驗檢測B細

12、胞表位的作用；表位融合蛋白注射免疫小鼠，通過特異性淋巴細胞增殖實驗檢測Th細胞表位作用。結(jié)果表明：表位疫苗融合蛋白產(chǎn)生的特異性抗體能夠與rureB、rHpaA、rLTB反應，且融合蛋白中LTB組分保持了與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合活性；抗表位融合蛋白的特異性抗體在一定程度上能夠抑制H．Pylori尿素酶的活性，并可阻止H．Pylori與胃上皮細胞的粘附和抑制H．Pylori與紅細胞的凝集反應；淋巴細胞增殖實驗證實三個Th表位肽能刺激表位疫苗免

13、疫小鼠的淋巴細胞發(fā)生特異性增殖(SI>2)，并且表位疫苗致敏的淋巴細胞在rUreB的刺激下可以增殖。實驗證明表位融合蛋白具有良好的免疫原性、免疫反應性并且所包含的各表位發(fā)揮了各自的免疫效應。 4．治療性幽門螺桿菌表位疫苗免疫治療BALB/c小鼠H．Pylori感染效果評價及機制探討 1)表位疫苗治療BALB/c小鼠H．Pylori感染效果評價：采用H．Pylori動物適應菌株SS1感染BALB/c小鼠，成功建立H．Pyl

14、ori感染動物模型，同時建立H．Pylori定量培養(yǎng)方法，根據(jù)H.pylori 16s rRNA編碼基因設計引物建立H．Pylori感染的PCR檢測方法。以表位融合蛋白Huepi-LTB和Huepi+rLTB每間隔7～10d，連續(xù)4次對感染H.pylori的BALB/c小鼠進行口服免疫治療，于治療38d后進行H.pylori定量培養(yǎng)檢測、尿素酶實驗、PCR檢測評價表位疫苗的治療效果。結(jié)果顯示表位融合蛋白能夠顯著降低小鼠胃粘膜H.pylo

15、ri的定植數(shù)量，清除率分別為64.2％和61.5％。 2)表位疫苗治療BALB/c小鼠H.pylori感染保護機制探討： H.Pylori感染小鼠予以表位疫苗口服免疫治療38d后，流式細胞術分析脾淋巴細胞亞群變化，淋巴細胞增殖實驗檢測脾和腸粘膜淋巴細胞的特異性增殖，ELISA檢測脾和粘膜淋巴細胞細胞因子的分泌，RT-PCR檢測脾和腸粘膜淋巴細胞IL-4和IFN-γmRNA表達水平，ELISA檢測特異性抗體IgG、IgA的

16、產(chǎn)生。 結(jié)果顯示：H.pylori超聲上清可顯著刺激表位疫苗免疫治療小鼠脾淋巴細胞和腸粘膜淋巴細胞特異性增殖，與PBS組、佐劑組和單純表位蛋白組差異顯著(P<0.01)；流式細胞術分析脾淋巴細胞亞群顯示CD4<'+>T淋巴細胞增殖明顯；疫苗作用下脾淋巴細胞和腸粘膜淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-4水平較對照組顯著升高(P<0.01)，RT-PCR結(jié)果顯示脾和腸粘膜淋巴細胞IL-4和IFN-γ mRNA表達水平明顯增高；體液免疫應答