幽門螺桿菌微球疫苗制備及其免疫效應(yīng)研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Hp)是引起人類慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等的主要致病菌，現(xiàn)階段在全世界人群中的感染率達50％以上，目前臨床上常用的三聯(lián)療法不足以根治Hp感染，且費用昂貴、病人依從性差、容易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥菌株。疫苗接種是徹底消除Hp感染的有效措施之一，根據(jù)共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)理論及文獻報道，口服途徑是其中最簡單、直接、安全且有效的給藥方式，但必須克服消化道中大量酸性、酶類物質(zhì)對抗原破壞的問題。 近年來，以微球(microsp

2、here，MS)、微囊、脂質(zhì)體等為代表的緩釋、控釋給藥制劑研究得到迅猛發(fā)展，它不僅能耐受各種復(fù)雜生理環(huán)境，而且還具有靶向給藥的特點。其靶向性決定于制劑本身粒徑大小，有文獻報道當(dāng)粒徑為1μm至10μm之間的MS經(jīng)口服后，既可以產(chǎn)生全身免疫，也可以在局部粘膜形成有效的免疫應(yīng)答。另外，由于MS具有顯著的緩釋特性，能夠使藥物在靶器官形成長時間的有效濃度，因此可以在一定程度上減少疫苗的免疫劑量及免疫次數(shù)。 Hp疫苗免疫保護機理的深入探討對

3、于Hp的有效防治及疫苗的研發(fā)會起到較大的推定作用。目前盡管對其進行了大量的研究，但其確切機制尚不清楚。本研究以Hp全菌蛋白(HpWCP)為抗原成分，主要從MS制備工藝及特征分析、免疫效應(yīng)、免疫保護及保護機理等三個方面進行了研究。 (一)HpWCP-CAMS的制備及其表征分析在本研究中，采用生物可降解天然高分子物質(zhì)—殼聚糖(chitosan，CTS)、海藻酸鈉(sodiumalginate，AGS)為MS主要制備材料，通過系統(tǒng)考察

4、制備材料水溶液的流動性、粘稠度、穩(wěn)定性等結(jié)果確定了AGS乳液濃度為2％、CTS濃度為1％、植物油與AGS乳液配比為2：8、CaCl2溶液反滴滴定法等MS制備工藝參數(shù)及程序。在此基礎(chǔ)上，對影響MS粒徑大小的因素進行均勻設(shè)計分析，并以確定的攪拌速率800rpm、藥物濃度2mg/ml、制備溫度25℃、攪拌時間30min等參數(shù)制備出平均粒徑為3.33μm殼聚糖—海藻酸鈉包裹牛血清白蛋白微球(BSA-CAMS)，其平均載藥量為31.5％，平均藥物

5、包封率為61.0％。電鏡觀察所得MS表面光整、大小均一。體外釋藥實驗結(jié)果顯示此MS具有良好的緩釋功能，最長釋藥時間可達到20d以上。在人工胃液中觀察其具有強耐酸性且對所包裹的蛋白抗原具有很好的保護效果，分別用3H-TdR和FITC標(biāo)記被包裹蛋白進行MS體內(nèi)靶向?qū)嶒灧治?，發(fā)現(xiàn)MS主要靶向至腸道粘膜組織并能夠被巨噬細胞吞噬。 以HpWCP作為主要的抗原成分采用上述工藝制備出殼聚糖—海藻酸鈉包裹Hp全菌蛋白微球(HpWCP-CAMS)

6、，經(jīng)檢測所制備MS平均粒徑3.58μm，載藥量為30.7％，包封率為63.5％，釋藥時間20d。體外毒性試驗顯示MS在5mg/ml濃度下，每實驗孔加入125μl作用72h仍不會對Hela細胞生長造成影響。體內(nèi)試驗結(jié)果顯示實驗小鼠生長健康，無異常反應(yīng)。凍干樣品能夠在25℃±2℃、濕度75％±5％及6℃±2℃、濕度60％±10％條件下穩(wěn)定存在，說明凍干品具有良好的穩(wěn)定性。小鼠致敏淋巴細胞試驗顯示實驗小鼠在MS免疫后2w，其體內(nèi)淋巴細胞就已經(jīng)

7、對抗原致敏，并且8w后仍具有較好的致敏性。 (二)HpWCP-CAMS免疫效應(yīng)研究針對HpWCP-CAMS的免疫效果研究，我們設(shè)計了7個實驗組進行比較：單純的HpWCP組(Ⅰ組)；HpWCP+CTS+AGS組(Ⅱ組)；HpWCP-CAMS組(Ⅲ組)；HpWCP+rLT組(Ⅳ組)；HpWCP+CTS+AGS+rLT(重組大腸桿菌不耐熱腸毒素)組(Ⅴ組)；HpWCP-CAMS+rLT組(Ⅵ組)及PBS對照組(Ⅶ組)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HpWC

8、P-CAMS不加佐劑組(Ⅲ組)血清特異性IgG均值為0.959±0.161、IgA均值為0.799±0.153；胃粘膜洗液中sIgA均值為0.964±0.165，腸粘膜洗液中sIgA檢測均值為1.036±0.324。以上結(jié)果與Ⅵ組結(jié)果相差不顯著(p＞0.05)，與Ⅳ組、Ⅴ組結(jié)果比較相差顯著(p＜0.05)，與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅶ組結(jié)果相差非常顯著(p＜0.01)。在MS免疫劑量、免疫周期、免疫次數(shù)及免疫程序等實驗研究中發(fā)現(xiàn)，MS能夠改善常規(guī)H

9、p疫苗制劑所存在的不足：MS50μg蛋白劑量組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平明顯高于常規(guī)蛋白組150μg劑量的抗體水平(p＜0.05)，而MS25μg蛋白劑量組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平與常規(guī)蛋白組150μg劑量的抗體水平相差不顯著(p＞0.05)。免疫周期研究中發(fā)現(xiàn)以第0、14、30、60d抗體水平明顯高于第0、14、30、90d及第0、30、60、90d組抗體水平(p＜0.05)，而與第0、7、14、21d組抗體水平相差不顯著(p＞0.05)。免疫次數(shù)

10、實驗中采用第0、14、30d分3次進行免疫同樣也能夠得到比較好的免疫效果；在免疫程序比較實驗中，應(yīng)用MS進行口服途徑免疫時，不管是否服用胃酸中和液，其抗體水平?jīng)]有明顯變化(p＞0.05)，說明MS本身具有很好的抗酸性，此結(jié)果與體外實驗結(jié)果相一致。由此我們可以得出，MS的靶向、緩釋的特點能夠使其克服傳統(tǒng)Hp疫苗免疫程序復(fù)雜、抗原用量大、免疫效果不肯定等諸多不足和缺陷。 (三)HpWCP-CAMS免疫保護試驗及免疫保護機理初探在小鼠

11、攻毒保護實驗中，在全程免疫后2w、5w、10w分別對小鼠進行攻毒試驗，2w后采用組織直接涂片、組織培養(yǎng)、HpDNA抽提后PCR擴增、糞便Hp全菌ELISA檢測等四種方法對感染效果進行檢測。結(jié)果顯示在3個不同時間點免疫后小鼠的免疫保護率分別達到94.4％、89.4％及94.7％，而對照組小鼠Hp感染率均在90％以上，說明HpWCP-CAMS能夠使小鼠得到很好的免疫保護效果。 在免疫保護機理探討實驗中，我們采用RT-PCR、ELIS

12、POT及流式細胞術(shù)進行細胞及基因水平的研究，在對脾臟及PP結(jié)內(nèi)IgA-ASC及IgG-ASC數(shù)量研究中發(fā)現(xiàn)，脾臟內(nèi)抗原特異性IgA-ASC數(shù)量由對照組的(0.99±0.14)×103/105上升為(5.24±0.85)×103/105，與對照組相差顯著(p＜0.05)，IgG-ASC水平由原來的(1.22±0.21)×103/105上升為(10.35±1.02)×103/105，與對照組相差非常顯著(p＜0.01)。小腸PP結(jié)內(nèi)IgA-

13、ASC的水平也由原來的(1.63±0.32)×103/105上升為(11.06±2.31)×103/105，與對照組相差非常顯著(p＜0.01)；IgG-ASC水平由原來的(1.02±0.35)×103/105上升為(5.69±1.06)×103/105，與對照組相差顯著(p＜0.05)。在對IL-4、IFN-γmRNA基因表達水平進行比較研究中發(fā)現(xiàn)，免疫后的小鼠脾臟淋巴細胞內(nèi)兩細胞因子mRNA水平均有較大程度的升高，說明HpWCP-C

14、AMS所誘導(dǎo)的保護性免疫應(yīng)答是TH1和TH2型反應(yīng)平衡作用的結(jié)果；采用流式細胞儀分析免疫后小鼠外周血發(fā)現(xiàn)，代表成熟T細胞總數(shù)的CD3+細胞以及其主要成分CD4+細胞分別由67.2％和31.8％上升到73.2％和42.9％，較對照組均有顯著升高(p＜0.05)，而CD8+細胞升高不明顯(p＞0.05)，考察機體免疫水平的CD4+/CD8+的比值也有一定程度升高，抑制性T細胞CD4+CD25+T細胞由10.3％上升到14.5％，較對照組升高

15、顯著(p＜0.05)，以上結(jié)果說明小鼠細胞免疫水平有所增強，說明Hp疫苗的免疫保護作用與細胞免疫有直接關(guān)系。本實驗中代表成熟B細胞總數(shù)的CD19+細胞數(shù)量由12.3％上升到18.6％，較對照組相差顯著(p＜0.05)，進一步驗證了Hp疫苗的免疫保護機制是體液免疫與細胞免疫共同起作用的結(jié)果。 結(jié)論：通過上述實驗研究制備出粒徑約為3.58μm的HpWCP-CAMS，其具有靶向腸道PP結(jié)組織的特性，具有良好的抗酸性及藥物緩釋功能，凍干