幽門螺桿菌ureB基因及其片段的表達(dá)和免疫研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種革蘭氏陰性菌、呈螺旋形，是引起人發(fā)生慢性活動(dòng)性胃炎、胃和十二指腸潰瘍的主要病原菌，同時(shí)與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生也密切相關(guān)。臨床現(xiàn)有的根除Hp的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素，但由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加、較高的花費(fèi)以及病人的低依從性等，限制了抗菌藥物的療效，因此，迫切需要進(jìn)行免疫防治研究工作。 幽門螺桿菌尿素酶是一種高親和力、高活性

2、和高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。純化尿素酶是由尿素酶A亞單位和B亞單位組成。尿素酶具有保護(hù)力、免疫原性、表面暴露和高度保守性，是幽門螺桿菌的主要抗原成分，尤其是尿素酶B亞單位(UreB)，已經(jīng)被證明可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答且具有較好的免疫保護(hù)性。但是，由于UreB分子較大，在大腸桿菌中不易重組表達(dá)，而且UreB的重組表達(dá)產(chǎn)物多為包含體形式，表達(dá)蛋白失去活性而且提取工藝復(fù)雜。因此，我們以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的具有分泌表達(dá)系統(tǒng)的大腸桿菌基因工程菌，即轉(zhuǎn)入ur

3、eB及其e、f、m三個(gè)不同片段的大腸桿菌為研究對(duì)象，分析不同重組蛋白(rUreB、E、F、M)的表達(dá)和免疫性質(zhì)。 1、借助生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)重組蛋白理化性質(zhì)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供依據(jù) 2、用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ureB基因及其小片段在大腸桿菌中均有特異性表達(dá)；用Western-blot檢測(cè)其抗原性，結(jié)果說明重組蛋白都具有一定抗原性；表達(dá)形式鑒定結(jié)果為rUreB

4、主要存在于包含體中，F(xiàn)在包含體、周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)組分中都有一定的蛋白積累，而M和E主要存在于周質(zhì)中；對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果為在對(duì)數(shù)中期加酸調(diào)節(jié)PH為5.5、繼續(xù)培養(yǎng)至12h時(shí)表達(dá)量最高。 3、將基因工程菌表達(dá)產(chǎn)物結(jié)合免疫佐劑皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/C小鼠，免疫四次，每次間隔7天，采集血清用ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中IgG和IgA水平，比較不同免疫原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答情況。BALB/c小鼠經(jīng)重組蛋白免疫后產(chǎn)生了具有顯著性的免疫應(yīng)

5、答(P＜0.01)，不同重組蛋白小鼠免疫組血清IgG水平強(qiáng)到弱依次為：M＞E＞rUreB＞F，小鼠血清IgA水平由強(qiáng)到弱依次為：E＞F＞rUreB＞M。 4、免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用幽門螺桿菌SS1對(duì)小鼠進(jìn)行攻擊，38天后用快速尿素酶試驗(yàn)、涂片實(shí)驗(yàn)和Giemsa染色對(duì)Hp在動(dòng)物胃內(nèi)的定植及生長情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，用HE染色對(duì)Hp攻毒實(shí)驗(yàn)后小鼠胃組織的病理情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討重組蛋白對(duì)Hp感染的免疫保護(hù)作用。結(jié)果表明小鼠經(jīng)Hp攻毒實(shí)驗(yàn)后胃組織全部