幽門螺桿菌HspA和UreB在蠶蛹中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物免疫活性的鑒定研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種能定植在胃和十二指腸粘液和粘膜的具有特殊能力螺旋形革蘭氏陰性細(xì)菌。目前，世界上有50％以上的人口感染有這種病原菌，其中百分之二十的感染者將會引起慢性胃炎、消化性和十二指腸潰瘍、胃癌和粘膜相關(guān)淋巴組織瘤的臨床癥狀。世界衛(wèi)生組織已把它作為I類致癌原。在發(fā)展中國家更加廣泛流行。目前，對有這種明顯疾病癥狀個體治療方法主要是用一種質(zhì)子泵結(jié)合二種或三種抗生素的聯(lián)合療法。有80％的根除率

2、和隨后的臨床癥狀的改善已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。該治療是有效的，但是，隨著抗菌素抵抗的增加、重新感染、并發(fā)癥和高治療費用限制了對幽門螺桿菌相關(guān)疾病的治療，因此，人抗幽門螺桿菌感染的保護(hù)和治療疫苗可能是控制這種感染的有效和經(jīng)濟(jì)的途徑。給實驗動物進(jìn)行免疫實驗的結(jié)果顯示，多種免疫方法在動物模型實驗中呈現(xiàn)幽門螺桿菌定植數(shù)大大減少。治療和保護(hù)疫苗中大多數(shù)是以應(yīng)用已了解的與幽門螺桿菌感染相關(guān)的病原菌的抗原為基礎(chǔ)的。許多研究已證明用幽門螺桿菌尿素酶B亞

3、單位(UrcB)免疫小鼠，能夠清除小鼠胃中的幽門螺桿菌感染，幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(HspA)也具有很強免疫原性，可以作為幽門螺桿菌疫苗的候選蛋白。
　　 1．利用Bac-to-Bac系統(tǒng)在蠶蛹中表達(dá)幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位和尿素酶B亞單位
　　 家蠶核多角體桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)有高表達(dá)水平和低成本等優(yōu)點。為了用家蠶表達(dá)螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(HspA)和尿素酶B亞單位（UreB），我們將hspA基因和egfp基

4、因克隆至pFastBacDual載體構(gòu)建了pFastBacDual-(EGFP)(HspA)供體載體，ureB基因克隆至pFastBacDual載體構(gòu)建了pFastBacDual-UreB，上述載體分別轉(zhuǎn)化Ecoli BmDH10Bac，通過篩選和鑒定獲得了重組Bacmid-(EGFP)(HspA)和Baemid-UreB:提取重組Bacmid-(EGFP)(HspA)和Bacmid-UreB DNA，轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞獲得重組桿狀病毒Bm

5、NPV-(EGFP)(HspA)和BmNPV- UreB: SDS-PAGE和Western-blot分析結(jié)果顯示，在感染重組桿狀病毒96 h的蠶蛹血淋巴中可檢測到13kDa和62kDa的特異性條帶，表明幽門螺桿菌的HspA、UreB在蠶蛹中成功表達(dá)，ELISA檢測結(jié)果顯示HspA、UreB的表達(dá)水平分別為0.52mg/ml和0.49mg/ml蠶血淋巴。
　　 2.EGFP與靶蛋白非融合共表達(dá)確定表達(dá)HspA蠶蛹中的最佳收獲時間

6、
　　 為了確定重組蛋白在蠶蛹中表達(dá)的時間過程和表達(dá)靶蛋白蠶蛹的最佳收獲時間，傳統(tǒng)的方法是從感染病毒72h后，開始每間隔12h收集蠶幼蟲或蠶蛹的血淋巴，通過SDS-PAGE或ELISA分析來確定靶蛋白的表達(dá)時間相，據(jù)此，確定收獲蠶蛹的時期。該過程難以實時追蹤靶蛋白的表達(dá)時相。為了實現(xiàn)靶蛋白表達(dá)水平的可視和實時追蹤，通過非融合的方式用P10和Pph啟動子分別控制EGFP和HspA基因，構(gòu)建重組桿狀病毒，實驗結(jié)果顯示，接種重組病毒蠶

7、蛹的熒光強度與重組HspA的表達(dá)水平有直接的對應(yīng)，表明可以根據(jù)蠶蛹的熒光強度確定表達(dá)HspA在蠶蛹中的最佳收獲時間。
　　 3．口服蠶蛹表達(dá)的UreB和HspA對小鼠抗幽門螺桿菌感染的免疫保護(hù)和治療效果評價
　　 幽門螺桿菌感染是一個重大的全球公共衛(wèi)生問題，其疫苗已經(jīng)成功地應(yīng)用人類預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染中?？诜庖弑Ｗo(hù)是抗幽門螺桿菌感染的一個很好的策略，因此，我們在成功建立幽門螺桿菌感染小鼠模式的基礎(chǔ)上，探討了口服蠶蛹

8、表達(dá)的UreB和HspA對小鼠抗幽門螺桿菌感染的免疫保護(hù)作用，并對其療效進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示，重組UreB和HspA口服免疫小鼠血清中特異性抗體滴度比對照組小鼠有明顯提升；口服含重組UreB蛋白蠶蛹粉的小鼠，細(xì)菌活體培養(yǎng)和PCR檢測有20％動物(n=10)胃幽門螺桿菌呈現(xiàn)陽性，尿素酶測試有10％動物(n=10)胃幽門螺桿菌呈現(xiàn)陽性，而未免疫組上述三種測試方法100％動物(n=10)胃幽門螺桿菌呈現(xiàn)陽性。表明口服重組抗原能誘導(dǎo)抗幽門螺桿菌