幽門螺桿菌HspA及CTB-HspA融合蛋白在家蠶中的表達(dá)與免疫效果研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是主要定植于宿主胃和十二指腸粘液或粘膜處的一種重要致病菌，與多種胃病及十二指腸疾病有密切關(guān)系。Hp是一種全球范圍的人類致病菌，世界上約有50％以上的人口感染此病原菌，我國(guó)目前約有50％～80％的感染人群，它是目前所知的人類感染率最高的感染菌之一，對(duì)人類身體健康造成了嚴(yán)重的危害?，F(xiàn)如今，針對(duì)此病原菌最常用的是聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑和兩種或三種抗生素的療法，雖然該療法有較好的療效，但耐藥性

2、增強(qiáng)、不良反應(yīng)和高費(fèi)用等因素使抗生素療法面臨嚴(yán)重的挑戰(zhàn)；另外，該療法只針對(duì)有病癥的患者，因此，如何在廣大的人群中有效控制Hp的感染，避免其誘發(fā)的一系列疾病的發(fā)生和發(fā)展，具有非常重要的意義?；蛞呙缇哂杏行У念A(yù)防性和治療性，有望成為控制Hp感染的最有效和最有前景的方法之一。
　　 本研究選擇Hp具有較強(qiáng)的免疫原性的熱休克蛋白A亞單位(HspA)進(jìn)行研究，首先將HspA基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.c

3、oliBL21(DE3)，成功構(gòu)建了重組表達(dá)菌株(pET-32a-HspA)；另外，為增強(qiáng)Hp抗原的免疫原性，Hp疫苗需配合免疫粘膜佐劑共同進(jìn)行免疫試驗(yàn)，因此同時(shí)構(gòu)建了免疫佐劑霍亂毒素B亞單位(CTB)的E.coli重組表達(dá)菌(pET-32a-CTB)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和序列同源性比較后發(fā)現(xiàn)，所得基因序列與Genbank公布的序列有非常高的同源性。分別將兩組重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，結(jié)果表明，重組菌可成功誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，且W

4、estern blotting鑒定結(jié)果證實(shí)其具有良好的免疫原性；對(duì)表達(dá)蛋白利用Ni2+-NTA柱親和層析及凝膠過(guò)濾層析和陰離子交換層析等一系列純化可得到純度為90％以上的目的蛋白，將純化后的HspA抗原蛋白進(jìn)行初步結(jié)晶條件的摸索，為Hp的防治奠定一定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；對(duì)純化的CTB蛋白進(jìn)行GM1-ELSA活性測(cè)定，結(jié)果證明其有良好的GM1結(jié)合活性，為后續(xù)佐劑研究奠定基礎(chǔ)。
　　 同時(shí)，本研究利用重疊延伸PCR法成功利用(Gly4Ser

5、)3連接肽序列構(gòu)建了CTB-HspA融合基因，生物信息學(xué)分析結(jié)果可知Linker兩端的蛋白保持原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性和親水性。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)成功構(gòu)建了重組桿狀病毒vBmCTB-HspA，分別感染家蠶BmN細(xì)胞、五齡幼蟲(chóng)和蠶蛹，利用家蠶生物反應(yīng)器中表達(dá)的HspA抗原和CTB-HspA融合蛋白，并對(duì)分別其進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blotting分析鑒定，結(jié)果表明目的蛋白在家蠶BmN細(xì)胞、五齡幼蟲(chóng)和蠶蛹均成功表