幽門(mén)螺桿菌基因敲除方法的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、目的：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori, H.pylori)是一種革蘭氏陰性的微需氧菌，他定植于胃黏膜上皮細(xì)胞的表面，以及胃小凹內(nèi)黏液深層。大量流行病學(xué)的研究調(diào)查顯示：全世界約有一半的人口中存在H. pylori的感染，它與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤以及胃腺癌等疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。大量研究也證實(shí)，多個(gè)H.pylori的毒力因子直接或間接地參與了上述的病理反應(yīng)，大部分主要集中于研究CagA, VacA

2、, UreB等毒力因子的研究方面，并且在H.pylori致病過(guò)程中也可能還存在其他重要的毒力因子。本研究旨在通過(guò)建立H. pylori體內(nèi)基因敲除方法來(lái)篩查新的H. pylori致胃病相關(guān)蛋白，并對(duì)其進(jìn)行基因改造和分析評(píng)價(jià)，以及對(duì)其致病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　 方法與結(jié)果：第一部分，我們選擇cagA, hp0596作為候選基因，從H.pylori26695基因組中分別擴(kuò)增得到此研究所需基因的上下游同源臂，與兩端帶有FRT位點(diǎn)的

3、氯霉素抗性基因片段共同構(gòu)建突變載體；以突變載體為模板擴(kuò)增打靶片段，將其轉(zhuǎn)化入H. pylori26695，在抗生素選擇壓力下，打靶片段和H.pylori菌體基因組發(fā)生同源重組，通過(guò)氯霉素抗性篩選得到帶有抗性標(biāo)記的重組菌轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)建立了在幽門(mén)螺桿菌中進(jìn)行基因打靶的技術(shù)方法。確定了實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，如打靶質(zhì)粒的濃度、高效的電轉(zhuǎn)化條件、所用抗生素的濃度和突變株的篩選培養(yǎng)方式，建立了相對(duì)高效的基因打靶的方法。在此基礎(chǔ)上

4、我們成功地對(duì)cagA,hp0596基因進(jìn)行了敲除，并在基因組水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 第二部分，為避免H. pylori重組菌株對(duì)抗生素選擇壓力的依賴，我們利用反選擇標(biāo)記sacB基因在幽門(mén)螺桿菌中建立了無(wú)痕敲除系統(tǒng)，即通過(guò)體內(nèi)基因敲除的方式構(gòu)建了打靶載體，并對(duì)其生長(zhǎng)表型作了綜合評(píng)價(jià)分析。具體而言，我們選定ureB基因作為我們進(jìn)行基因敲除的目標(biāo)，利用同源重組原理，成功敲除了幽門(mén)螺桿菌中ureB基因，并且結(jié)合反

5、選擇系統(tǒng)sacB基因的作用，得到不含抗性標(biāo)記的突變株H.pylori26695(ΔureB)。研究表明與野生菌株相比突變菌株尿素酶的功能缺失，這樣通過(guò)正負(fù)兩步置換選擇法在幽門(mén)螺桿菌中建立了體內(nèi)基因無(wú)痕敲除的方法。
　　 第三部分，構(gòu)建穿梭載體，實(shí)現(xiàn)Salmonella的腸黏附素蛋白在HPSS1株外膜蛋白上的表達(dá)。利用λRed系統(tǒng)將穿梭質(zhì)粒pHH43進(jìn)行改造，將菌蛻基因genE及其上游的溫度敏感型啟動(dòng)子和下游的cat抗性基因，通過(guò)