幽門螺桿菌的培養(yǎng)鑒定及其基因分型方法學的建立.pdf

1、背景和目的: 幽門螺桿菌(Hp)是目前世界上最常見的人類感染細菌之一,全球約50﹪左右的人群均感染過Hp,僅次于齲齒,中國的感染率約為60﹪.大量的研究已經(jīng)表明,Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍的主要致病因素,并與胃癌、胃MALT淋巴瘤的發(fā)生也密切相關.1994年世界衛(wèi)生組織將其列為第一類生物致癌因子.但是在研究中人們發(fā)現(xiàn),并非所有Hp感染者都會患胃腸疾病,這就說明只有部分Hp與疾病相關,且有可能不同類型的Hp與不同的疾病相關,于是有

2、學者就開始進行Hp型別與疾病關系的研究.由于Hp是一種表型特征一致、但基因變異很高的細菌,故表型分型方法的分型效率比較低,許多分子分型方法應運而生.在這些分子分型方法中,PCR產(chǎn)物分型因其操作簡單、方便、所需模板量少等優(yōu)點而在實際中得到廣泛使用.故本研究建立一種直接PCR方法針對Hp三類主要毒力因子ureA、cagA和vacA基因及vacA基因亞型進行綜合分析分型,希望從Hp的基因水平上來探討其與不同上消化道疾病之間的關系.另外,由于H

3、p生長條件要求苛刻,培養(yǎng)起來即復雜又困難,因此本研究還對Hp的培養(yǎng)及鑒定方法進行了一定的摸索. 材料與方法:標本來源于在寧波鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院因上消化道癥狀進行胃鏡檢查,采取胃竇黏膜,通過對患者胃竇粘膜組織進行增菌、分離培養(yǎng)、挑取可疑菌落涂片鏡檢,并對其進行有關Hp生化反應鑒定;對分離鑒定的Hp菌株進行DNA提取;采用PCR擴增特異性ureA基因鑒定菌株.采用特定引物對各菌株基因型進行PcR擴增,擴增產(chǎn)物在2﹪瓊脂糖凝膠中進行電泳;在

4、凝膠分析系統(tǒng)中觀察電泳并照相.擴增產(chǎn)物通過克隆測序,BLAST同源分析驗證. 結果: 1.本研究146例胃竇粘膜活檢標本中,培養(yǎng)鑒定84例Hp陽性菌株,培養(yǎng)Hp陽性率為57.53﹪. 2.培養(yǎng)鑒定的84例Hp菌株中,ureA基因的陽性率10096(84/84),cagA基因的陽性率為90.48﹪(76/84),vacA基因的陽性率95.24﹪(80/84),cagA、vacA在胃癌中的陽性率均較低,與胃炎、消化性

5、潰瘍比較有顯著性差異. 3.PCR產(chǎn)物經(jīng)過BLAST同源分析,PCR鑒定基因型結果與測序結果一致. 4.VacAm2基因的陽性率為79.76﹪(67/84),vacAmla基因的陽性率20.24﹪(17/84),vacAmlb基因8,33﹪(7/84),vacAmlbm24.76﹪(4/84),比較分析各基因組Hp在各疾病組間陽性率,vacAm2在胃癌中的陽性率最低,與胃炎、消化性潰瘍比較有顯著性差異,vacAm2在消化

6、性潰瘍中的陽性率與胃炎比較無顯著性差異,其余3個vacA基因亞型在胃炎、消化性潰瘍、胃癌陽性率比較均無顯著性差異. 5.VacAm2亞型在胃炎、消化性潰瘍的陽性率較高(77.78﹪,86.44﹪),與cagA(83.33﹪,96.78﹪)比較差異無顯著性,VacA其他三個亞型在胃炎、消化性潰瘍的陽性率均較低,與cagA比較差異有顯著性 結論: 1.本試驗Hp培養(yǎng)鑒定改良了Hp培養(yǎng)的配方,使得培養(yǎng)更簡單易行,陽性率