河南地區(qū)慢性胃炎、消化性潰瘍患者攜帶的幽門螺桿菌基因分型.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)感染是一個全球性的衛(wèi)生問題，也是目前人類發(fā)生率最高的慢性細菌感染之一，全球50﹪左右的人群感染過H-pylori。大量的研究表明，H.pylori是消化性潰瘍及慢性胃炎的主要致病因子，與胃癌和胃黏膜相關淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue， MALT)淋巴瘤的發(fā)生也具有一定的關系。1994年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(int

2、emational agency for research on cancer， IARC)正式將H.pylori列為第一類生物致癌因子；美國疾病預防控制中心也已經(jīng)將H.pylori感染性疾病列為新出現(xiàn)的傳染病之一。 但是，并非所有感染H．pylori的人都會發(fā)病，大約20-30﹪的感染者可終身攜帶H．pylori而不發(fā)生胃炎、消化性潰瘍等H.pylori相關性疾??；50﹪以上的感染者僅有不同程度的慢性炎癥；10-15﹪的感染

3、者可發(fā)生消化性潰瘍；只有極少數(shù)發(fā)生胃部惡性腫瘤。不同類型的H．pylori菌株感染以及不同宿主的遺傳免疫學差異可能是導致不同疾病結局的根本原因。本研究擬從病原學的角度探索H.pylori基因型別與不同感染結局的之間的關系。有關H.pylori致病多樣性的機制目前還不十分清楚，基于H.pylori表型特征的一致性和基因結構高度變異性的特點，本研究選取與H.pylori毒力高度相關的毒力島基因作為研究對象，結合針對H．pylori基因組的隨

4、機擴增多態(tài)性DNA分析，探索H.pylori基因分型方法。 對象與方法 1.研究對象分組：以臨床確診的慢性胃炎(chronic gastritis，CG)患者為來源的H.pylori為慢性胃炎組；以臨床確診的消化性潰瘍(gastric ulcer，Gu)患者為來源的H.pylori為潰瘍組；其他來源的為非慢性胃炎非潰瘍組(no-patient of CG/GU，NP)。 2．幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)：胃鏡下常規(guī)方法

5、獲取胃腸疾病患者胃黏膜組織塊，研磨后涂抹接種于改良布氏培養(yǎng)基；或通過胃管采集住院病人的清晨空腹胃液，調(diào)整pH，離心取沉淀涂抹接種于上述培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)箱微需氧環(huán)境培養(yǎng)5-7天，對可疑菌落進行菌落形態(tài)、革蘭氏染色和生化鑒定，取陽性者傳代增菌。 3. 幽門螺桿菌基因組RAPD分析：酚-氯仿法提取H.pylori基因組DNA，以5'-CCGCAGCCAA-3'為引物序列進行隨機擴增，瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，BIO IMAGI

6、NG成像系統(tǒng)紫外觀察并照相。與標準分子量DNA相比較，估計出每個擴增片段的分子量，以所有片段分子量作為變量進行編碼，有為1，無為0，記錄全部菌株的檢測結果，輸入SPSS13.0軟件進行聚類分析。 4.幽門螺桿菌vacA、cagA、cagE和cagT基因多態(tài)性分析：PCR擴增vacA、cagA、cagE和cagT基因片段，編碼擴增結果，比較這些基因在CG、PU、NP組的分布情況，并進行聚類分析。 5.綜合分型：由于92株

7、H.pylori中均擴增得到了vacA基因片段，在菌株之間不具有定性差別，對基因分型沒有貢獻，因此不作為綜合分型的變量?；蚪MRAPD分析結果與cagA、cagE和cagT基因多態(tài)性分析結果綜合為一個數(shù)據(jù)庫，進行聚類分析，多檢測方法、多基因性狀聯(lián)合對H.pylori分型。 6.幽門螺桿菌VacA毒素活性檢測：提取H.pylori空泡細胞毒素，提取物與96孔板中長成單層的Hela細胞在體積分數(shù)50﹪CO2，37℃條件下共同孵育24

8、hrs，光學倒置顯微鏡觀察結果并照相保存。 結果 1.基因組RAPD分析結果：92株H.pylori呈現(xiàn)出各自不同的RAPD基因指紋圖譜，說明H．pytori的基因組變異度極高，RAPD指紋圖可作為H．pylori的菌株標示。SPSSl3．O軟件聚類分析，可將全部H．pylori分為4個基因型別，此4個型別在慢性胃炎組、消化性潰瘍組和非慢性胃炎非潰瘍組的分布經(jīng)統(tǒng)計學檢驗證實差異沒有顯著性(P=0．77)。 2．

9、vacA、cagA、cagE和cagT基因分析結果：PCR擴增vacA、cagA、cagE和cagT基因片段，全部菌株中均擴增出了vacA，菌株之間不存在有或無的定性差別；部分菌株缺失了cagA、cagE和cagT中的一個或幾個，在菌株之間呈現(xiàn)出多態(tài)性。依據(jù)cagA、cagE和cagT檢測結果，聚類分析可以將92株H-pylori分為2個型別，CG、PU、NP三組研究對象的基因型別構成差異不具有統(tǒng)計學意義(P=0．45)。 3

10、．綜合分型結果：對RAPD分析結果與cagA、cagE和cagT檢測結果進行綜合聚類分析，全部菌株分為4個基因型別。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，慢性胃炎、消化性潰瘍、非慢性胃炎非潰瘍組基因型構成不同(P=0.03)，三者各有自己的優(yōu)勢基因型。 4．VacA毒素活性檢測結果：本次實驗50﹪(46/92)的菌株表達了VacA活性，但是活性表達情況既沒有在不同疾病組之間表現(xiàn)出差異(P=0．96)，也沒有在各基因型之間表現(xiàn)出差異(P=0．54)。

11、 結論 本病例對照研究應用RAPD和PCR技術檢測92株臨床分離的幽門螺桿菌基因特點，通過統(tǒng)計學聚類分析將這些菌株區(qū)分為不同的型別，結論如下： 1．92株H．pylori呈現(xiàn)出各自不同的基因組隨機擴增多態(tài)性DNA指紋圖譜，RAPD指紋圖可作為區(qū)分不同H．pylori的菌株標示；但是RAPD單一分型方法不能將本次研究中分離得到的河南地區(qū)H．pylori有效分型。 2．本研究獲得的全部H．pylori均具有vac

12、A基因；部分菌株缺失了cagA、cagE、cagT三者中的一個或者幾個，在菌株間呈現(xiàn)出多態(tài)性。依據(jù)cagA、cagE、cagT檢測結果進行聚類分析，不能對本研究中的H．pylori有效分型。 3．依據(jù)RAPD與cagA、cagE、cagT檢測結果進行綜合分型，CG、PU、NP組的基因型別構成不同，H．pylori基因型與疾病類型有關。 4．本研究中VacA活性表達情況與H.pylori基因型別的聯(lián)系、與不同疾病結局的聯(lián)系