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文檔簡介
1、目的:克隆并鑒定幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)NCTC11637cagL編碼基因;原核表達(dá)并純化CagL融合蛋白;觀察其融合蛋白對細(xì)胞株GES-1表達(dá)IL-8 mRNA能力的影響,并探討cagL基因在H.pylori cag致病島(cagpathogenicity island,cag PAI)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system,TFSS)中的作用,為進(jìn)一步闡明H.py
2、lori的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
方法:
1.根據(jù)GenBank收錄的H.pylori22695全基因組序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增cagL基因的引物,利用PCR技術(shù)從H.pyloriNCTC11637基因組DNA中擴(kuò)增獲取cagL基因,T-A克隆后進(jìn)行序列測定;并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究;
2.構(gòu)建PET-28a(+)-cagL原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)陽性
3、菌株表達(dá)后,SDS-PAGE法和Western Blot法鑒定目的蛋白,并用Ni2+-NTA樹脂分離純化所表達(dá)的CagL融合蛋白;
3.將融合蛋白CagL與弗氏佐劑充分乳化后,免疫家兔,制備抗CagL多克隆抗體;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中抗體效價(jià);
4.不同濃度的融合蛋白CagL與GES-1細(xì)胞作用一定時(shí)間后,提取細(xì)胞總RNA,
4、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-8 mRNA的表達(dá);
5.收集H.pylori,重懸并裂解菌體,經(jīng)高速離心分離得到各菌體組分蛋白,包括周質(zhì)間隙蛋白、胞質(zhì)蛋白及內(nèi)外膜蛋白;利用Western Blot法檢測CagL蛋白的亞細(xì)胞定位;
6.將制備的CagL多克隆抗體按不同比例與幽門螺桿菌共孵育后,分別加入至細(xì)胞GES-1中,作用一定時(shí)間后;Western Blot法檢測細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cyto
5、toxin-associated gene A,CagA)在抗體中和前后轉(zhuǎn)運(yùn)的影響;
結(jié)果:
1.PCR擴(kuò)增獲得的cagL基因全長為654 bp,編碼217aa,(申請GenBank的登錄號為GU937872)與GenBank公布的其它H.pylori菌株的基因序列同源性為96%~98%,氨基酸同源性為97%~99%,蛋白的相對分子質(zhì)量Mr約為32KDa,軟件預(yù)測顯示有多個(gè)明顯的具有抗原活性的結(jié)構(gòu)域。
6、 2.成功構(gòu)建了PET-28a(+)-cagL原核表達(dá)載體,確定IPrG終濃度1mmol/L,溫度30℃,誘導(dǎo)時(shí)間4h為最佳誘導(dǎo)條件,經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot法鑒定有目的蛋白表達(dá);通過Ni2+-NTA樹脂分離純化目的蛋白,獲得原核表達(dá)的CagL融合蛋白。
3.獲得CagL融合蛋白多克隆抗體,效價(jià)為1∶3.2×105。
4.CagL融合蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞GES-1表達(dá)IL-8 mRNA,并
7、且該效應(yīng)呈濃度依賴性。
5.Western Blot結(jié)果顯示CagL蛋白定位于菌體內(nèi)外膜;經(jīng)CagL多克隆抗體中和作用后,其菌體轉(zhuǎn)運(yùn)CagA的蛋白量隨抗體量的增加而逐漸降低,表明抗體中和作用后能夠抑制CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。
結(jié)論:
本研究通過克隆表達(dá)cagL基因,獲得CagL融合蛋白;并且證實(shí)CagL可誘導(dǎo)細(xì)胞株GES-1表達(dá)IL-8 mRNA,該效應(yīng)呈濃度依賴性;CagL蛋白定位于菌體內(nèi)外膜,通
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