幽門螺桿菌cagA轉(zhuǎn)基因小鼠胃病理表型與分析.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的發(fā)現(xiàn)是20世紀(jì)胃腸病學(xué)領(lǐng)域的一大重要事件?，F(xiàn)已明確H.pylori是慢性胃炎、胃和十二指腸消化性潰瘍、胃腺癌和胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤的主要病因。1994年世界衛(wèi)生組織將其歸為Ι類致癌因子。H.pylori的毒力致病因子主要包括:尿素酶、鞭毛、黏附素、脂多糖、空泡毒素及細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白CagA等。通常以H.pylori是否表達(dá)VacA和CagA毒力蛋白進(jìn)行分型,其

2、中I型H.pylori具有典型的以cagA為標(biāo)志的細(xì)菌致病島(cag pathogenicity island),稱其為cagPAI。在大量的研究中證明,是否含有cagPAI是H.pylori具有較強(qiáng)毒力的重要標(biāo)示,同時(shí)在H.pylori的致病過(guò)程中cagPAI也起到了重要的作用。
　　CagA蛋白具有多態(tài)性,其C端的EPIYA基序在來(lái)自東亞型和西方型的H.pylori中有明顯的不同。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,西方型和東亞型H.pylori的

3、CagA蛋白其致病能力不同。但由于H.pylori具有多種致病因子,長(zhǎng)期感染H.pylori的動(dòng)物模型并不能演示單一CagA蛋白的致病作用。而cagA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞雖可揭示CagA的致病機(jī)制,并避免H.pylori其他致病因子的影響,但并不能準(zhǔn)確模擬H.pylori在體內(nèi)的致病過(guò)程。
　　基于以上原因,本課題組成功建立了東亞型(cagA-9810,羧基端含有EPIYA-ABD基序)和西方型(cagA-Ca52,羧基端含有EPIYA

4、-ABC基序)2個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。本課題在此工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了如下三個(gè)方面的研究:
　　1.在DNA水平進(jìn)行了cagA基因整合拷貝數(shù)與完整性檢測(cè)
　　為了確保CagA蛋白在cagA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)進(jìn)行有效表達(dá),在得到cagA-9810和cagA-Ca52二個(gè)品系轉(zhuǎn)基因小鼠子代后,我們首先對(duì)2個(gè)品系4個(gè)亞系小鼠染色體上所插入的cagA片段的拷貝數(shù)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明cagA-Ca52品系的AC155亞系、GC996亞系和ca

5、gA-9810品系的YB081亞系、YB053亞系小鼠基因組所插入的cagA基因片段拷貝數(shù)分別為5、8、6、6拷貝。其次我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因小鼠插入cagA基因片段的完整性,分別在cagA基因5’端和3’端靶序列區(qū)域設(shè)計(jì)PCR引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在所有品系和亞系的小鼠均檢測(cè)到了陽(yáng)性擴(kuò)增條帶,且測(cè)序正確。
　　2.進(jìn)行了小鼠體內(nèi)CagA表達(dá)水平檢測(cè)
　　在經(jīng)過(guò)DNA水平檢測(cè)后,我們?cè)赗NA水平對(duì)cagA基因的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了檢測(cè)。

6、提取小鼠胃組織RNA,進(jìn)行RT-PCR,結(jié)果表明cagA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠可以進(jìn)行cagA基因轉(zhuǎn)錄,且擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果正確。以CagA蛋白及其C端連接的HA標(biāo)簽為靶標(biāo)進(jìn)行了Western-Blot檢測(cè)。結(jié)果表明CagA蛋白在cagA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠體內(nèi)獲得了表達(dá)。
　　3.CagA表達(dá)陽(yáng)性小鼠胃病理表型分析
　　我們針對(duì)6-18月齡的cagA-Ca52和cagA-9810品系共148只小鼠進(jìn)行了病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)觀察,其中ca

7、gA-Ca52陽(yáng)性小鼠57只,cagA-9810陽(yáng)性小鼠59只,同窩陰性對(duì)照小鼠32只。結(jié)果表明:CagA表達(dá)陽(yáng)性小鼠的胃部發(fā)生的了明顯的炎癥、息肉樣增生、腺瘤樣增生及腸化生等病變,其中息肉樣增生、腺瘤樣增生及腸化生可列為癌前病變。以Ki-67抗體進(jìn)行免疫組化染色分析,發(fā)現(xiàn)在部分病變小鼠胃粘膜腺頸部、胃小凹、胃底腺出現(xiàn)了細(xì)胞核深染,細(xì)胞增殖旺盛的現(xiàn)象。經(jīng)阿爾新藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)部分小鼠胃底腺出現(xiàn)肥大粘液細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)表明,東亞型cagA轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)

8、生癌前病變比例為51％,西方型轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生癌前病變比例為28%。兩個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因小鼠在觀察期限內(nèi)胃部及十二指腸都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的癌癥病灶,但是CagA表達(dá)陽(yáng)性小鼠發(fā)生疾病的比例要遠(yuǎn)高于同籠陰性對(duì)照組小鼠,且觀察到了癌前病變。
　　總之,在獲得了東亞型cagA轉(zhuǎn)基因小鼠cagA-9810(EPIYA-ABD)和西方型轉(zhuǎn)基因小鼠cagA-Ca52(EPIYA-ABC)后,經(jīng)過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠DNA、RNA及蛋白水平的檢測(cè),以及病理學(xué)、病理