轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗口服免疫大白兔的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在獲得含目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄第三代種子的基礎(chǔ)上，應(yīng)用PCR、Western blot、ELISA技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行鑒定及目的蛋白濃度測(cè)定，進(jìn)一步對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行口服免疫實(shí)驗(yàn)，初步探索表達(dá)PAcA/CTB、PAcP/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄免疫大白兔的免疫效果。
　　 方法：本研究包括兩個(gè)部分
　　 實(shí)驗(yàn)一：轉(zhuǎn)基因番茄中外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB）及外源

2、目的蛋白的檢測(cè)
　　 1.PCR法篩選含編碼變異鏈球菌表面蛋白基因與霍亂毒素B亞單位融合基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄植株。2.BCA法測(cè)定總蛋白的含量。3.Westernblot確定目的蛋白的表達(dá)。4.ELISA法檢測(cè)外源目的蛋白的濃度。
　　 實(shí)驗(yàn)二：轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗口服免疫大白兔的實(shí)驗(yàn)研究。1.動(dòng)物的選擇與分組：32只新西蘭大白兔隨機(jī)分為A、B、C、D四大組：其中A組包含三個(gè)劑量組：A1組

3、：以7ml/kg劑量喂食表達(dá)PAcA/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白53.3μg）；A2組：以10ml/kg劑量喂食表達(dá)PAcA/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白76.20μg）；A3組：以13ml/kg劑量喂食表達(dá)PAcA/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白99.06μg）。B組包含三個(gè)劑量組：B1組：以7ml/kg劑量喂食表達(dá)PAcP/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白65.62μg）；B2組：以10m

4、l/kg劑量喂食表達(dá)PAcP/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白93.74μg）：B3組：以13ml/kg劑量喂食表達(dá)PAcP/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含目的蛋白121.87μg）。C組為陰性對(duì)照組：以10ml/kg劑量喂食非轉(zhuǎn)基因番茄汁。D組為陽性對(duì)照組：喂食滅活全菌疫苗（1ml/次），共8個(gè)組，每組4只動(dòng)物。2.免疫途徑：喂食免疫。3.免疫時(shí)間：每周免疫一次，連續(xù)免疫4周。4.樣品采集時(shí)間：分別于首次免疫前和免疫后第1、

5、2、3、4、5、6、7、8、10、12周采集血液、唾液樣品，測(cè)量動(dòng)物體質(zhì)量。5.特異性抗體的檢測(cè)：血清和唾液中IgG、IgA采用ELISA法檢測(cè)。6.于免疫后12周處死動(dòng)物，取其心、肝、脾、肺、腎行病理學(xué)檢查，觀察免疫后各器官組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：①以轉(zhuǎn)基因番茄植株總DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳后見約450bp或506bp大小擴(kuò)增條帶，與陽性對(duì)照一致。②BCA法分別測(cè)得總蛋白含量為4.644mg/ml和3.456mg

6、/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離出分子量約60KD大小的蛋白條帶，Western blot雜交證實(shí)該條帶為嵌合蛋白PAcA/CTB或PAcP/CTB。目的蛋白的濃度分別為7.62μg/ml和9.37μg/ml，分別占總可溶性蛋白的0.16％和0.27％。③分別以不同劑量番茄汁喂食免疫動(dòng)物后，大白兔血液和唾液中特異性抗體水平在免疫后1周逐漸升高，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組特異性抗體水平明顯高于陰性對(duì)照組（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組比較差

7、異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各劑量組間比較差異不明顯；④相同時(shí)間點(diǎn)各組大白兔體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。⑤除陽性對(duì)照組心內(nèi)膜出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象外，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組未見明顯的病理學(xué)改變
　　 結(jié)論：①本課題組培育的轉(zhuǎn)基因番茄成功表達(dá)了嵌合蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB，PAcA/CTB、PAcP/CTB含量分別占番茄果實(shí)可溶性總蛋白的0.16％和0.27％。②表達(dá)外源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄免疫新西蘭大白