防齲基因疫苗pVAX1-GC免疫BALB-c小鼠和SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察防齲基因疫苗pVAX1-GC經(jīng)不同途徑免疫BALB/c小鼠和SD大鼠后特異性抗體水平和降低SD大鼠齲齒的程度，通過(guò)動(dòng)物體重等一般安全性指標(biāo)的檢查，初步篩選出該疫苗的有效免疫途徑，為新型防齲基因疫苗pVAX1-GC的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：本研究包括三個(gè)實(shí)驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)一：重組質(zhì)粒pVAX1-GC及空載體質(zhì)粒pVAX1的鑒定和大量制備。
　　 1.先小量抽提儲(chǔ)存的重組質(zhì)粒pVAX1-GC及空

2、載體質(zhì)粒pVAX1。
　　 2.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組質(zhì)粒pVAX1-GC及空載體質(zhì)粒pVAX1是否正確。
　　 3.在鑒定正確的基礎(chǔ)上，大量抽提重組質(zhì)粒pVAX1-GC及空載體質(zhì)粒pVAX1，紫外分光光度計(jì)測(cè)定所抽提的重組質(zhì)粒的OD值，并計(jì)算其濃度和純度，貯存于-800C冰箱中以備免疫動(dòng)物用。
　　 實(shí)驗(yàn)二：重組質(zhì)粒pVAX1-GC免疫BALB/c小鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組：6-8周

3、齡健康BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為：A組(陰性對(duì)照組)：用空載體質(zhì)粒pVAX1股四頭肌注射免疫動(dòng)物。B組(空白對(duì)照組)：用生理鹽水鼻腔滴注免疫動(dòng)物。C組：質(zhì)粒pVAX1-GC雙側(cè)頜下腺區(qū)皮下注射免疫動(dòng)物。D組：質(zhì)粒pVAX1-GC鼻腔滴注免疫動(dòng)物。E組：質(zhì)粒pVAX1-GC股四頭肌注射免疫動(dòng)物。
　　 2.免疫時(shí)間、免疫劑量和樣本采集：共免疫3次，每周免疫一次，連續(xù)免疫3周。每次每只小鼠免疫劑量為100

4、μg。分別于免疫第0、1、2.3、4W(即實(shí)驗(yàn)進(jìn)程第0、8、15、22、29d)采集血液、唾液樣品。血清中IgG和唾液中S-IgA采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接ELISA法)檢測(cè)。
　　 3.動(dòng)物一般安全性的檢驗(yàn)：每周稱量各組動(dòng)物的體重，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各器官大體形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)有無(wú)異常變化。
　　 實(shí)驗(yàn)三：重組質(zhì)粒pVAX1-GC免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　

5、　 40只出生18天的SD大鼠，雄性，建立齲齒模型后隨機(jī)分組。分組情況、免疫時(shí)間、免疫劑量、特異性抗體的檢測(cè)及動(dòng)物一般安全性檢查的方法同實(shí)驗(yàn)二；分別于免疫前(即0周)和免疫后第1、2、3、4、5、6W(即鼠齡28、35、42、49、56、63、70d)取血清和唾液樣本。鼠齡70天時(shí)，處死動(dòng)物，并取上下頜骨，進(jìn)行齲齒計(jì)分。
　　 結(jié)果：①重組質(zhì)粒pVAXl-GC經(jīng)Kpn I、EcoR I雙酶切為3.Obp和537bp兩的兩個(gè)片段

6、，與目的基因片段大小相同。通過(guò)特大型質(zhì)粒試劑盒抽提獲得了純度為1.890，濃度為1580μg/ml的高純度質(zhì)粒。②重組質(zhì)粒pVAX1-GC經(jīng)鼻腔黏膜滴注、頜下腺區(qū)皮下注射和股四頭肌注射等三種途徑免疫BALB/C小鼠和SD大鼠，在動(dòng)物血液和唾液中均可檢測(cè)到特異性抗體，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③三種途徑免疫SD大鼠后，大鼠患齲水平明顯降低，與對(duì)照組比較有明顯差異(P<0.05)。④通過(guò)雙側(cè)頜下腺區(qū)皮下注射途徑免疫動(dòng)物

7、誘導(dǎo)的唾液特異性S-IgA抗體水平最高。⑤免疫前后動(dòng)物體重對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯的差異(P>0.05)。BALB/C小鼠和SD大鼠的心、肝、脾、肺、腎等重要臟器經(jīng)大體觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，病理切片檢查均無(wú)細(xì)胞核深染或核分裂像，胞質(zhì)均勻，未見(jiàn)特異性病理改變。
　　 結(jié)論：①防齲基因疫苗pVAX1-GC能有效誘導(dǎo)BALB/C小鼠和SD大鼠血液與唾液中特異性抗體的產(chǎn)生，表明重組質(zhì)粒pVAX1-GC能在動(dòng)物體內(nèi)正確表達(dá)并誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體的