四種藥物致Balb-c小鼠肝臟毒性的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、藥物不良反應(yīng)是長期以來危害人體健康的一個(gè)醫(yī)學(xué)難題，當(dāng)前各國由藥物不良反應(yīng)所引發(fā)的疾病都呈上升趨勢，同時(shí)它也是眾多新藥開發(fā)和臨床運(yùn)用的難題和障礙，對藥物毒性機(jī)制進(jìn)行深入研究有重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)意義，但傳統(tǒng)的藥物毒理學(xué)研究缺乏在分子水平上進(jìn)行綜合分析的手段，使藥物毒理研究與發(fā)展相對滯后。 毒理基因組學(xué)為藥物毒理研究引入了新的研究理論和技術(shù)手段，基因芯片等高通量基因組技術(shù)手段可以同時(shí)觀察藥物毒性作用引發(fā)的數(shù)以千計(jì)的基因的表達(dá)變化模式，而

2、這種基因表達(dá)譜上所顯現(xiàn)的毒性終點(diǎn)往往具有較好的敏感性和特異性，有助于對毒性機(jī)制的闡明。目前此方面工作正在廣泛開展并取得許多成果。肝臟是人體藥物代謝的主要器官，藥物引發(fā)的肝毒性損傷占臨床藥物不良反應(yīng)的相當(dāng)比例，因此眾多研究均從藥物肝毒性動(dòng)物模型入手。 本課題是以本室與香港城市大學(xué)聯(lián)合構(gòu)建的小鼠毒理基因芯片為技術(shù)平臺(tái)，建立四種具肝毒性效應(yīng)的臨床藥物(紅霉素、四環(huán)素、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺)的Balb/c小鼠肝毒性模型，對比研究各藥物作

3、用后不同時(shí)相點(diǎn)和劑量點(diǎn)小鼠肝臟基因表達(dá)譜變化，為在分子水平上探索藥物肝臟毒性作用機(jī)制積累資料，同時(shí)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室與香港城市大學(xué)聯(lián)合構(gòu)建的小鼠毒理基因芯片用于藥物毒性評價(jià)的可行性。本研究分為三部分進(jìn)行：第一部分，建立四種藥物致Balb/c小鼠肝毒性損傷模型；第二部分，設(shè)計(jì)制作小鼠毒理基因芯片，建立相應(yīng)芯片檢測流程，并進(jìn)行相關(guān)質(zhì)控分析和可靠性驗(yàn)證；第三部分，利用小鼠毒理基因芯片觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟基因表達(dá)譜變化，并結(jié)合聚類分析及生物信息數(shù)據(jù)庫

4、檢索等手段對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，探討藥物致肝臟毒性的作用機(jī)制。主要的結(jié)果如下： 1.本研究建立了紅霉素、四環(huán)素、環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺四種藥物的Balb/c小鼠不同時(shí)相和劑量的肝毒性作用模型，體重指標(biāo)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)多個(gè)藥物組動(dòng)物平均體重下降，提示動(dòng)物機(jī)體能量代謝障礙；各組動(dòng)物血漿肝功生化指標(biāo)和肝臟病理切片觀察發(fā)現(xiàn)各藥物引起肝臟不同程度和類型的毒性損傷。 2.挑選與環(huán)境化合物致癌、外來化合物/藥物代謝及毒性效應(yīng)相關(guān)的1796個(gè)基因片

5、段，構(gòu)建小鼠毒理基因芯片及配套數(shù)據(jù)庫。 3.建立本芯片的樣本RNA提取、芯片雜交和數(shù)據(jù)分析方案，采用局部均值化標(biāo)準(zhǔn)化方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。 4.評估本芯片質(zhì)量監(jiān)測指標(biāo)并進(jìn)行包含熒光交換重復(fù)的差異表達(dá)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示芯片雜交結(jié)果片內(nèi)數(shù)據(jù)特異性和重復(fù)性均較好，片間數(shù)據(jù)相關(guān)性較好。抽檢芯片雜交結(jié)果部分基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)變化趨勢基本一致，證實(shí)芯片結(jié)果可靠性。 5.芯片檢測各藥物組基因表達(dá)譜，共篩

6、選差異表達(dá)基因302個(gè)，按GeneOntology功能分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了功能檢索分類。 6.分層聚類法對各藥物組表達(dá)譜分別進(jìn)行了樣本聚類和基因聚類。樣本聚類結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺組聚類接近，紅霉素和四環(huán)素組聚類接近，四環(huán)素和環(huán)磷酰胺兩個(gè)低劑量組在樣本聚類中分類特征不明顯?；蚓垲惤Y(jié)果顯示在多個(gè)藥物組中呈現(xiàn)共同下調(diào)趨勢的基因有46個(gè)，共同上調(diào)趨勢基因51個(gè)，分別涉及脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、抗氧化、炎癥發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞

7、周期調(diào)控、藥物代謝等多種功能機(jī)制。 7.綜合分析不同生物學(xué)功能類別的差異基因表達(dá)變化，提示各藥物組可能分別存在以下一些與毒性效應(yīng)和機(jī)體調(diào)節(jié)相關(guān)的機(jī)制：肝臟脂肪酸分解代謝和脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)功能的障礙，可能導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積和過氧化發(fā)生；肝臟組織細(xì)胞修復(fù)再生和蛋白質(zhì)降解均較活躍；機(jī)體能量代謝障礙；肝臟組織存在藥物作用后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，藥物抑制部分抗氧化基因表達(dá)；肝臟組織一些炎癥應(yīng)激基因上調(diào)，部分免疫調(diào)節(jié)功能基因受抑；眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)控

8、相關(guān)基因發(fā)生改變，總體趨勢傾向于促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。部分藥物轉(zhuǎn)運(yùn)及Ⅰ、Ⅱ相代謝途徑相關(guān)基因受抑，影響藥物肝臟代謝作用。 8.比較四環(huán)素和環(huán)磷酰胺低劑量組與高劑量組表達(dá)譜，差異表達(dá)一致率較低，提示不同作用劑量下基因表達(dá)調(diào)控存在不同的模式。差異表達(dá)一致的基因反映在不同劑量下共同存在的毒性效應(yīng)機(jī)制，但并無明顯的量效關(guān)系。僅在兩低劑量藥物組差異表達(dá)的基因推測主要與細(xì)胞對藥物作用的適應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)。 綜合以上研究結(jié)果我們認(rèn)為，本室與香