BALB-C小鼠胚胎與成鼠皮膚無瘢痕愈合相關(guān)基因篩選、克隆與轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、皮膚組織是人體最大的器官，其主要功能為隔離和屏障作用，避免身體受到外界的感染和傷害。瘢痕(scar)是皮膚軟組織和各個器官損傷后所引起局部形態(tài)和組織學(xué)及病理學(xué)等變化的統(tǒng)稱，它是高等哺乳動物的皮膚、軟組織和器官受到一定程度損傷后修復(fù)和重建過程的必然產(chǎn)物，是正常組織形態(tài)和功能的不完全替代。瘢痕的形成不僅影響患者的美觀和心理健康，肥厚性瘢痕、瘢痕攣縮及瘢痕疙瘩更是能夠引起患者的功能喪失、運動感覺障礙及嬰幼兒患者的生長受限。瘢痕癌則直接威脅著患

2、者生命安全。因此，防治皮膚軟組織器官損傷后的瘢痕形成、瘢痕增生，減少瘢痕組織對患者外表、功能和心理的損害是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點之一。
　　觀察發(fā)現(xiàn)，器官再生和無瘢痕愈合往往出現(xiàn)在低等動物體內(nèi)，高等哺乳動物皮膚軟組織損傷往往以瘢痕愈合形成功能替代為終點。然而上世紀(jì)70年代Burrington(1)發(fā)現(xiàn)將剖宮后經(jīng)過手術(shù)的羊胚胎再放入子宮后，出生后羊羔皮膚上無瘢痕形成。隨后，Harrisond(2)等對17例18-28周的人類胚胎進(jìn)

3、行手術(shù)后再放回子宮，嬰兒出生后皮膚上也沒有瘢痕出現(xiàn)，表明人類胚胎的皮膚、軟組織和部分內(nèi)臟器官具有創(chuàng)傷后無瘢痕愈合和重建的能力，并由此提出了“無瘢痕愈合(scarless wound healing)”的概念，即人類和高等哺乳動物孕早中期胚胎的皮膚軟組織及部分器官具有深度創(chuàng)傷后可以完美修復(fù)重建且沒有瘢痕組織形成的特性，這種現(xiàn)象說明瘢痕這種不完全功能和形態(tài)的組織替代并不是人類和高等哺乳動物皮膚、軟組織和器官創(chuàng)傷或損傷愈合的唯一途徑。孕早中期

4、胚胎皮膚和軟組織完美修復(fù)重建的主要組織學(xué)特征總結(jié)如下:①胚胎皮膚等組織損傷后無明顯急性炎癥反應(yīng)或炎癥反應(yīng)維持在較低水平;②胚胎皮膚的真皮細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)的含量較成體皮膚明顯升高，而透明質(zhì)酸酶的合成及活性明顯降低;③胚胎皮膚無瘢痕愈合后真皮中各型膠原纖維呈正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)整齊排列，而瘢痕組織中的膠原纖維排列雜亂無序且各型膠原蛋白比例有明顯差異。根據(jù)上述結(jié)論可以得出與高等哺乳動物胚胎皮膚等組

5、織無瘢痕愈合相關(guān)的幾個要素:(1)胚胎所處子宮內(nèi)環(huán)境因素:無瘢痕愈合與胚胎傷口周圍羊水提供的子宮內(nèi)環(huán)境有特定關(guān)系。羊水中含有較多的前列腺素(prostaglandin，PG)、透明質(zhì)酸等已證實能夠促進(jìn)傷口愈合的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)在胚胎創(chuàng)傷后組織修復(fù)和重建中發(fā)揮了積極作用。實驗證實:羊水本身既有提高膠原酶(collagenase)活性的作用，也有降低透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)、彈性蛋白酶(elastase)和組織蛋白酶(

6、cathepsin)等多種降解酶活性的作用，羊水就是通過影響與膠原和透明質(zhì)酸的合成與降解相關(guān)的各種酶的活性達(dá)到調(diào)節(jié)胚胎傷口中特定膠原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）合成比例與增加透明質(zhì)酸含量的作用。(2)無論是胚胎還是成體哺乳動物，皮膚、軟組織和器官的成纖維細(xì)胞(fibro-bl ast，F(xiàn)B)是損傷修復(fù)的主要功能細(xì)胞，成纖維細(xì)胞向傷口的游走速度和時機(jī)，各型膠原蛋白合成、分泌及其比例在傷口的愈合過程起到了關(guān)鍵作用。實驗證實，孕早期胚胎皮膚傷口中成纖維細(xì)

7、胞較成人皮膚傷口成纖維細(xì)胞的游走能力明顯增強(qiáng)，同時胚胎皮膚傷后3-5天創(chuàng)面組織中即可見到大量成纖維細(xì)胞聚集，而成人傷后7天的創(chuàng)面才出現(xiàn)成纖維細(xì)胞游走和分泌。(3)胚胎皮膚軟組織細(xì)胞外基質(zhì)有其特殊之處:胎兒組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的組成成分與成人有明顯差異，成人皮膚傷口內(nèi)透明質(zhì)酸和纖維蛋白僅僅在創(chuàng)傷早期少量分泌，然后迅速分解，并且被各型膠原蛋白（其中Ⅰ型膠原比例75％，Ⅲ型膠原比例25％）替代;而

8、胎兒皮膚傷口的ECM成分和含量與胎兒正常皮膚相同，透明質(zhì)酸含量較成體皮膚顯著升高，膠原纖維（其中Ⅲ型膠原比例60％）呈規(guī)則網(wǎng)狀排列。隨著妊娠時間延長，孕后期開始胚胎皮膚愈合模式從無瘢痕愈合逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轳：塾现敝脸錾?。如果能夠在成體皮膚軟組織和器官實現(xiàn)無瘢痕愈合，就可以從根本上解決組織損傷后瘢痕愈合引起的一系列問題，從而獲得損傷及手術(shù)后皮膚、軟組織和器官完美重建甚至組織器官再生的理想化結(jié)果。
　　幾十年的研究表明瘢痕形成主要與三方

9、面因素相關(guān):1、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分解失衡。Sato M等(3)的研究表明在三維立體培養(yǎng)體系中，瘢痕疙瘩(keloid)和肥厚性瘢痕(hypertrophic scar，HTS)的前α1(Ⅰ)、前α1(Ⅲ)膠原的mRNA水平比正常水平高20倍。Friedman DW等(4)的試驗表明前α1膠原基因在keloid和HTS中的翻譯效率均有增高，但只有在keloid中發(fā)現(xiàn)前α1膠原基因的mRNA水平隨Ⅰ型膠原生成量增加而相應(yīng)穩(wěn)定增長。Arak

10、awa等(5)用Northern印跡雜交的方法發(fā)現(xiàn)HTS中編碼膠原酶mRNA含量和表達(dá)顯著降低，同時膠原酶的活性明顯下降。說明創(chuàng)面成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的過度合成及分解降低是肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩發(fā)生的關(guān)鍵因素。2、多種類型細(xì)胞因子在瘢痕愈合過程中有重要雙向調(diào)節(jié)功能。轉(zhuǎn)化生長因子β1，2，3(transforming growthfactor-β1，2，3，TGF-β1，2，3)是當(dāng)前已確認(rèn)的與keloid和HTS形成密切相關(guān)，同

11、時也是研究最多的細(xì)胞因子之一。Occlestong(6)等通過在成年小鼠，大鼠和豬的傷口中（模擬子宮內(nèi)胚胎內(nèi)環(huán)境）加入相應(yīng)抗體降低PDGF、TGFbetal和TGFbeta2的表達(dá)或人為加入外源性TGFβ3，均獲得了類似胚胎皮膚無瘢痕愈合的結(jié)果。說明成體哺乳動物損傷的皮膚及軟組織在特定條件下也可以模擬類似胚胎無瘢痕修復(fù)的過程。TGFβ3是哺乳動物胚胎組織無瘢痕愈合的關(guān)鍵因子。在成體哺乳動物皮膚創(chuàng)面添加外源性TGFβ3顯著降低了傷后早期細(xì)

12、胞外基質(zhì)中膠原蛋白等的沉積，而這些蛋白質(zhì)分子的大量沉積影響了傷口真皮組織的塑形和重建。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)(7)不僅在促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及分化、維持神經(jīng)系統(tǒng)正常功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)肽分泌等方面扮演重要角色，同時有促進(jìn)損傷修復(fù)、參與新的毛細(xì)血管生成等重要功能。Rapala K等(6)的研究證明IL-1β和PGE2能夠少量提高前α1(Ⅰ)、前α1(Ⅲ)膠原的mRNA水平，卻分別減少膠原產(chǎn)量15％和34％。C

13、ao PF等(9)證實HOXA9基因具有誘導(dǎo)皮膚表皮干細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)從而引起HTS和keloid中血管過度增生。3、遺傳學(xué)機(jī)制在瘢痕、肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩的生成中扮演主要角色。Tsou R等(10)使用基因芯片檢測技術(shù)，通過普通瘢痕和HTS與正常皮膚比較發(fā)現(xiàn)有142個基因過量表達(dá)，同時71個基因表達(dá)量降低。Stelnicki EJ(11)通過比較

14、胚胎和成體皮膚的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者有多個同源異型基因的特異表達(dá)（如:HoxB13，PRX-2，MSX-1，MSX-2，MOX-1等），認(rèn)為這些基因在胚胎和成體皮膚中差異表達(dá)可能是胚胎皮膚完美重建和修復(fù)的關(guān)鍵因素。
　　在疾病基因組研究中目前經(jīng)常采用的差異顯示技術(shù)(DD-PCR)、Northern雜交、點雜交和基因芯片技術(shù)(genechip)等方法雖然能夠全面顯示兩個樣本間mRNA的差異，但是容易遺漏微量存在的特異表達(dá)基因mRNA攜

15、帶的大量遺傳信息并且假陽性率明顯偏高或者只能夠比較已知基因的差異，無法篩選未知基因。
　　據(jù)此設(shè)計了本試驗，采用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)，分別抽提BALB/C小鼠孕14天鼠胚皮膚組織的mRNA和3月齡BALB/C小鼠皮膚組織的mRNA為試驗材料，通過雙向消減雜交技術(shù)、抑制性PCR技術(shù)和巢式PCR技術(shù)，篩選并克隆分別在兩種皮膚組織中特異表達(dá)的共23個cD

16、NA片段并構(gòu)建了兩個相應(yīng)的cDNA文庫。其中獲得16個在鼠胚皮膚特異表達(dá)的cDNA片段和7個在成鼠皮膚特異表達(dá)的cDNA片段，這些cDNA片段均有可能與瘢痕形成或無瘢痕愈合有關(guān)。隨后將篩選的cDNA片段分別進(jìn)行克隆、基因測序、網(wǎng)上查新，最后使用NCBI的blast和DNAstar等分子生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析。發(fā)現(xiàn)多數(shù)cDNA片段源于已知基因，其中大部分與各型細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)，其中2個源于鼠胚皮膚的cDNA片段未曾報道。
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