瘤背石磺內(nèi)參基因篩選和皮膚發(fā)育相關(guān)基因EGF和IF的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、瘤背石磺（Onchidium struma）是生活于灘涂濕地的半咸水兩棲性生物，隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、肺螺亞綱（Pulmonata）、縮眼目（Systellommatophora）、石磺科（Onchidiidae），是一種具有很高的食用和藥用價(jià)值的貝類。其生活區(qū)域常見(jiàn)于中國(guó)的江蘇省、上海市、浙江省、福建省、廣東省等地的淡水與海水交匯處的高潮帶，其溫度適應(yīng)能力強(qiáng)、分布范圍廣、野生資源量非常豐

2、富。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于石磺的研究工作主要集中在系統(tǒng)分類學(xué)、生物學(xué)形態(tài)特征、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定、胚胎發(fā)育和繁殖機(jī)制以及活性物質(zhì)的分離提取等方面。
　　表皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖發(fā)育，中間絲蛋白在維持細(xì)胞形態(tài)上發(fā)揮重要作用，內(nèi)參基因的篩選是進(jìn)行基因定量分析的前提條件。石磺科的蛻皮現(xiàn)象涉及到上皮細(xì)胞的大量更新，其運(yùn)動(dòng)能力則與肌肉細(xì)胞的形變程度有聯(lián)系。本文對(duì)瘤背石磺進(jìn)行了內(nèi)參基因的初步篩選，初步探討功能基因EGF和IF的理化結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系

3、，并針對(duì)兩基因在石磺蛻皮與否和運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)弱上進(jìn)行了較為深入的分析，希望能為研究瘤背石磺生物學(xué)類兩棲特性相關(guān)的功能基因積累資料。
　　1．依托瘤背石磺轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)庫(kù)，挑選出7個(gè)常用內(nèi)參基因的序列作為候選基因，經(jīng)NCBI上BLAST比對(duì)及初步鑒定后，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，統(tǒng)計(jì)分析各候選基因在瘤背石磺不同組織中表達(dá)的穩(wěn)定性。BestKeeper軟件分析顯示其穩(wěn)定性大小為：EF1α＞TUBB＞RPL28＞Ubiq＞18SrRNA=CY

4、C＞ACTB；在geNorm軟件的分析結(jié)果里，穩(wěn)定性的大小為：EF1α＞RPL28＞CYC＞Ubiq＞TUBB＞18S rRNA＞ACTB；而Normfinder軟件給出的穩(wěn)定值排序?yàn)椋篍F1α＞RPL28＞Ubiq＞CYC＞TUBB＞18SRNA＞ACTB。常用內(nèi)參基因的ACTB的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）最大，其表達(dá)穩(wěn)定性在7個(gè)候選基因中最低，穩(wěn)定性最高的候選基因?yàn)镋F1α。在瘤背石磺的不同組織表達(dá)分析時(shí)篩選出最適合內(nèi)參基因?yàn)镋F1α，而由No

5、rmfinder軟件給出的最優(yōu)內(nèi)參基因組合為EF1α和RPL28。
　　2．從瘤背石磺背部皮膚組織中克隆得到了瘤背石磺表皮生長(zhǎng)因子（Os-egf1）基因，并進(jìn)行序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和組織表達(dá)水平測(cè)定。利用RACE克隆技術(shù)所獲得的Os-egf1基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1158bp，其開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為846bp，并編碼一條長(zhǎng)為281個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈；沒(méi)有明顯的信號(hào)肽，分子量為30.51kDa，該基因存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（膜內(nèi)

6、1-16aa,膜上17-39aa，膜外40-281aa），亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該多肽位于細(xì)胞核內(nèi)，理論等電點(diǎn)（PI）是5.41，為一個(gè)偏酸性的蛋白。有6個(gè)Ser、3個(gè)Thr、3個(gè)Tyr可能為蛋白激酶磷酸化作用的位點(diǎn)。Os-egf1氨基酸的序列中半胱氨酸（Cys）殘基明顯較多，占氨基酸殘基總數(shù)的11.40％，并不分布于多肽鏈的N端和C端，多集中于肽鏈的中段部分。半胱氨酸殘基主要分布在對(duì)應(yīng)的三個(gè)EGF-like的結(jié)構(gòu)域里，且結(jié)構(gòu)域中至少6個(gè)半胱氨

7、酸殘基參與形成CX7 CX4-5 CX10-13 CXCX8 C的類似結(jié)構(gòu)，推測(cè)其相互之間形成的3對(duì)二硫鍵為維持結(jié)構(gòu)域特定的空間結(jié)構(gòu)所必需。除去結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基，該基因的序列保守性非常低，進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示EGF家族中不同成員各自聚為一支。瘤背石磺不同組織的相對(duì)定量分析顯示 Os-egf1高表達(dá)于背部皮膚，表皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖分裂，初步推測(cè)Os-egf1基因與瘤背石磺蛻皮現(xiàn)象明顯與否有關(guān)。
　　3．從瘤背石磺背部皮膚

8、組織中克隆了瘤背石磺中間絲蛋白（Os-IF1）基因，序列拼接結(jié)果顯示，所克隆得到的Os-IF1基因的cDNA核酸序列全長(zhǎng)為1957bp，其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1359bp，并編碼一條長(zhǎng)為452個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。沒(méi)有明顯的信號(hào)肽，分子量為51.54kDa，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)該多肽位于細(xì)胞核內(nèi)，理論等電點(diǎn)為5.21，為一個(gè)偏酸性的蛋白，含有23個(gè)Ser、14個(gè)Thr、6個(gè)Tyr蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。Os-IF1預(yù)測(cè)的氨基酸序列中

9、，以α螺旋為主，占據(jù)整條多肽鏈的82%，符合中間絲蛋白的典型特征。氨基酸序列的同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與中間絲蛋白家族成員的序列同源性較高。在相對(duì)定量表達(dá)分析中，Os-IF1在瘤背石磺中表達(dá)量較高的為前觸角和腹足兩個(gè)組織，而其他三種石磺表達(dá)量最高的組織均為腹足，推測(cè)該基因產(chǎn)物與石磺運(yùn)動(dòng)過(guò)程中腹足肌肉的收縮有關(guān)。不同種石磺之間的表達(dá)分析顯示，瘤背石磺中的表達(dá)量最高，具體原因有待于進(jìn)一步的探究。序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)該基因的保守性非常高，而進(jìn)化樹(shù)基本表現(xiàn)為