韭蛆內(nèi)參基因篩選及關(guān)鍵解毒酶基因克隆與轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性研究.pdf

1、韭蛆是危害多種蔬菜的主要害蟲，在中國多個省份均有報道，是蔬菜生產(chǎn)的大敵。韭蛆又稱根蛆主要危害韭菜，因棲居在韭菜根部，防治極難。隨著菜農(nóng)對化學(xué)農(nóng)藥的濫用和過分依賴，韭蛆的選擇壓力，其對各種化學(xué)藥劑的抗性逐漸增強，使得韭蛆的防治受到的艱巨的挑戰(zhàn)。而分子生物學(xué)方面的研究尚未見報道，昆蟲的解毒酶系在其抵抗外界環(huán)境脅迫起到極其重要的作用。對其解毒酶機制中的關(guān)鍵解毒酶基因?qū)Σ煌袠?biāo)農(nóng)藥的表達(dá)水平的了解，有助于在分子水平上，尤其是從生態(tài)友好的角度上對

2、昆蟲的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　　本文以高通量Illumina Hiseq2000獲得的韭蛆轉(zhuǎn)錄組為背景，對不同處理樣本的韭蛆內(nèi)參引物進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選，并對韭蛆ABC轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和非專一性酯酶(ESTs)關(guān)鍵解毒酶基因進(jìn)行克隆，同時對其4種解毒酶基因在辛硫磷、毒死蜱、毗蟲啉、氟嘧啶不同脅迫時間下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，具體結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用Real-Tim

3、e PCR技術(shù)，在內(nèi)參基因的篩選中對RPL10、EF1α、G6PDH、UBC、ACT、RPS3、TUB、GAPDH、EF2α等九個候選內(nèi)參基因在23個不同處理樣本進(jìn)行了篩選。通過geNorm和Norm finder分析顯示，在不同發(fā)育時期最適內(nèi)參基因為ACT，最適雙內(nèi)參基因為ACT和EF2α;不同組織中最適內(nèi)參基因為EF1α，最適雙內(nèi)參基因為EF1-α和ACT;不同性別中最適的內(nèi)參基因為RPL10，EF1-α和RPL10;不同農(nóng)藥脅迫下

4、最適內(nèi)參基因為RPL10，雙內(nèi)參基因為RPL10和RPS3。
　　2.對韭蛆4個解毒酶基因，ABC轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和非專一性酯酶(ESTs)進(jìn)行了基因克隆，所獲得核苷酸序列分別為1275、1733、609、801個堿基。
　　系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明:韭蛆CPY基因與同屬雙翅目家族的家蠅CYP基因同源性最近，同源性高達(dá)97％，比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆GST基因與

5、家蠅，黑果蠅同源性高達(dá)97％和96％，比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆EST基因與雙觸目蚊科埃及伊蚊和白紋伊蚊同源性達(dá)到98％，親緣關(guān)系比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆ABC轉(zhuǎn)運蛋白與岡比亞按蚊基因同源性為95％，親緣性比其他昆蟲家族同源性更近。
　　3.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)分析韭蛆在不同農(nóng)藥不同處理時間4種基因的表達(dá)水平。得到如下結(jié)果:本試驗發(fā)現(xiàn)在辛硫磷處理下谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)量變化不顯著，而ABC轉(zhuǎn)運蛋

6、白及EST酶系表達(dá)量顯著提高。預(yù)測韭蛆對辛硫磷的解毒作用中，谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶系不行使相應(yīng)解毒功能，而起到主要作用的是ABC轉(zhuǎn)運蛋白及酯酶(EST)酶系。在毒死蜱脅迫下，四種解毒酶隨著時間基因表達(dá)量均顯著提高，尤其是ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)的提高最顯著，并且持續(xù)時間較長，說明在毒死蜱脅迫下ABC轉(zhuǎn)運蛋白起到主要的解毒作用;在煙堿類農(nóng)藥（吡蟲啉）脅迫下，隨著時間除了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)受影響較小以外，其他三種基因隨著時間的變化，均