瑞氏木酶木聚糖代謝關(guān)鍵酶基因克隆及基因表達(dá)調(diào)控區(qū)研究.pdf

1、該文采用PCR方法從T.reesei QM9414 cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到木聚糖酶I(Xylanase I, XYN I)基因,克隆至載體pUC19上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUC19-xynI.對(duì)pUC19-xynI上插入的含有木聚糖酶I基因外源片段進(jìn)行了測(cè)序和序列分析.測(cè)序結(jié)果表明:T.reesei QM9414 木聚糖I結(jié)構(gòu)基因由669個(gè)核苷酸殘基組成,編碼223個(gè)氨基酸,與報(bào)道略有差異.對(duì)木聚糖酶I進(jìn)行的同源模建表明瑞氏木霉木聚糖酶I屬

2、于典型的G/11族糖基水解酶.把木聚糖酶I基因連接到酵母表達(dá)穿梭載體pAJ401的PGK啟動(dòng)子與PGK終止子之間,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pAJ401-xynI.將其轉(zhuǎn)化釀酒酵母H158,獲得了能分泌木聚糖酶的重組釀酒酵母.為研究木聚糖酶I基因5'端非翻譯區(qū)對(duì)基因表達(dá)的影響,采用PCR法刪除了木聚糖酶I基因起始密碼子ATG上游79個(gè)堿基的非翻譯區(qū)序列,構(gòu)建了含有5'UTR缺失xynI的重組質(zhì)粒pAJ401-xynId 以及相關(guān)的重組釀酒酵母菌株H

3、158(pAJ401-xynId).實(shí)驗(yàn)表明,xynI 5'UTR 刪除后,木聚糖酶I表達(dá)水平比野生型提高2.3倍.由此推測(cè),xynI mRNA 5'端非翻譯區(qū)中可能存在酵母調(diào)控蛋白的結(jié)合位點(diǎn)或可以形成強(qiáng)的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而影響xynI在酵母中的表達(dá).將酵母PGK啟動(dòng)子與終止子定向連接到pRS425的克隆位點(diǎn),構(gòu)建了酵母表達(dá)穿梭載體pRS425-pgk.pRS425-pgk 篩選標(biāo)記為L(zhǎng)eu,外源基因在酵母PGK啟動(dòng)子控制下表達(dá).pRS42