木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因克隆、表達及活性分析.pdf

1、能源是人類社會發(fā)展的基礎(chǔ),隨著石化燃料等非再生能源的日漸減少,新能源、清潔能源尤其是可再生能源得到了各國的關(guān)注。其中,以燃料乙醇為代表的生物燃料已經(jīng)成為關(guān)注熱點。如何利用廉價的,可再生的植物纖維素和半纖維素生產(chǎn)乙醇是當前研究的熱點,其中半纖維素主要由木糖組成。由于釀酒酵母缺乏木糖異構(gòu)酶以及沒有足夠酶活力的木酮糖激酶(木酮糖激酶是關(guān)鍵酶)不能直接代謝木糖生成乙醇。本項目研究木糖異構(gòu)酶及木酮糖激酶基因克隆并在酵母中的表達與生物活性分析。

2、r>　　 本研究以E.coli DH5α基因組DNA為模板,通過PCR方法擴增木糖異構(gòu)酶基因(xi)和木酮糖激酶基因(xk),并分別使其基因的3’末端融合了His標簽,便于蛋白的純化?？寺〉玫降腄NA片段與pPIC9K、pGAP9K載體均用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后連接,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌,獲得了帶有AOX1啟動子的重組質(zhì)粒(pPIC9K-xi、pPIC9K-xk)和帶有GAP啟動子的重組質(zhì)粒(pGAP9K-xi、pGAP9K-xk)

3、。
　　 利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將線性化后的質(zhì)粒pPIC9K-xi、pPIC9K-xk、pGAP9K-xi、pGAP9K-xk轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115,經(jīng)MD板和700μg/mL的G418抗生素篩選得到多拷貝重組菌株GS115(pPIC9K-xi)、GS115(pPIC9K-xk)、GS115(pGAP9K-xi)、GS115(pGAP9K-xk)作為工程菌。外源蛋白的表達在搖瓶中進行,GS115(pPIC9K-xi)和GS

4、115(pPIC9K-xk)以甲醇為唯一碳源,而GS115(pGAP9K-xi)和GS115(pGAP9K-xk)葡萄糖為唯一碳源。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶成功地在巴斯德畢赤酵母中分泌表達。隨后用木糖發(fā)酵試驗作活性分析,結(jié)果表明搖瓶發(fā)酵的重組木糖異構(gòu)酶都具有生物活性。
　　 利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將線性化后的質(zhì)粒pGAP9K-xi和pGAP9K-xk轉(zhuǎn)化釀酒酵母京龍1號,經(jīng)MD板和700μg/mL的G418抗

5、生素篩選得到多拷貝重組菌株JL1(pGAP9K-xi)、JL1(pGAP9K-xk)。搖瓶發(fā)酵工程菌株JL1(pGAP9K-xi)和JL1(pGAP9K-xk),表達木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶。隨后用木糖發(fā)酵試驗作活性分析,結(jié)果表明搖瓶發(fā)酵的重組木糖異構(gòu)酶具有生物活性。
　　 綜上所述,本實驗成功地克隆了木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因,實現(xiàn)了在巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母中表達木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶。同時,證明了酵母表達來源于大腸桿菌的木糖