產(chǎn)乙醇菌株的選育及木糖代謝關(guān)鍵酶基因的克隆.pdf

1、生物乙醇作為一種清潔可再生能源,被納入許多國家的能源發(fā)展規(guī)劃。廉價的原料和高效轉(zhuǎn)化工藝是燃料乙醇商業(yè)化生產(chǎn)的必要條件,利用可再生植物纖維資源生物轉(zhuǎn)化制取乙醇的研究成為當前的熱點,尤其是利用纖維素生產(chǎn)燃料乙醇,而纖維素糖化液的高效轉(zhuǎn)化和木糖轉(zhuǎn)化成乙醇是關(guān)鍵因素之一。其中木糖的高效乙醇發(fā)酵是該技術(shù)工業(yè)化的基礎(chǔ)和制約因素。尋求性能優(yōu)良的木糖發(fā)酵菌株和研究微生物木糖代謝工程成為當前研發(fā)的重點。本研究從酒曲和牛糞樣品中分別篩選到一個發(fā)酵蔗渣糖化液

2、產(chǎn)乙醇的菌株和一個發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的菌株。經(jīng)形態(tài)學分析、理化特性鑒定和分子生物學鑒定,確定這兩個菌株分別屬于釀酒酵母屬(命名為Saccharomyces cerevisiae Q2-1)和熱帶假絲酵母屬(命名為Candida tropicalis H-1)。對S.cerevisiae Q2-1發(fā)酵蔗渣糖化液產(chǎn)乙醇的條件進行研究。通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化,該菌株在起始pH值為5.5,溫度為30℃的條件下,利用含有0.4%硫酸銨的發(fā)酵培養(yǎng)基靜置發(fā)

3、酵60h,發(fā)酵率可以達到89.18%,1g蔗渣可以轉(zhuǎn)化成0.136g乙醇。提取Candida tropicalis H-1總DNA,設(shè)計引物,通過基因克隆,從C.tropicalisH-1的總DNA上克隆到木糖還原酶基因(xyl1)和木糖醇脫氫酶基因(xyl2),分析這兩個基因的序列,沒有內(nèi)含子。將基因xyl1和xyl2插入pPIC3.5K,構(gòu)建了整合載體pPIC3.5K-xyl1-xyl2,電轉(zhuǎn)化至Pichia stipitis GS

4、115中。xyl1和xyl2通過同源臂交換整合至GS115染色體上,通過菌落PCR篩選,獲得了重組子GS115-xyl1-xyl2。木糖還原酶(XR)是NAD(P)H依賴性氧化還原酶,以NADPH或NADH為輔酶,木糖醇脫氫酶(XDH)以NAD~+為專一輔酶。用甲醇誘導重組子表達,通過細胞破碎,收集粗酶液。測得粗酶液中XR和XDH的相對酶活分別為12.3U和1.1U,重組蛋白XR對輔酶NADPH的依賴性要比對輔酶NADH的依賴性大,表明