鰱魚葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、隨著我國漁業(yè)的發(fā)展,水產(chǎn)品產(chǎn)量持續(xù)增加,魚糜制品已成為淡水魚加工利用的一個主要方向。但是,魚糜制品生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的凝膠劣化現(xiàn)象嚴(yán)重影響制品質(zhì)量。本研究室已從多種魚類肌肉中提取到肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(Myofibril Bound Serine Protein,MBSP),且發(fā)現(xiàn)該酶能催化肌原纖維產(chǎn)生降解作用,推測其與凝膠裂化現(xiàn)象密切相關(guān)。該酶的抑制劑肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Myofibril Bound Serine P

2、rotein Inhibitor,MBSPI)現(xiàn)也已從多種魚類中得到分離純化,并證明其本質(zhì)是葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI),該抑制劑能有效抑制MBSP對肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MHC)的降解作用。海水白姑魚的GPI對淡水鯉魚的MBSP無抑制作用,同樣淡水鯽魚的GPI也不能抑制白姑魚MBSP的活性,提示GPI對MBSP的抑制作用具有種屬特異性。
　

3、　本實驗以鰱魚為研究對象,以GPI的保守位點堿基序列為依據(jù)設(shè)計引物,利用RT-PCR方法并結(jié)合cDNA快速末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)得到了兩條編碼鰱魚GPI的基因序列,命名為GPIA、GPIB,GenBank登錄號分別為JF958124和JF907593,推導(dǎo)的氨基酸序列GenBank登錄號分別為AEI61932和AEH76920。
　　GPIA的cDNA全長為2

4、008 bp,開放閱讀框為1662 bp,共編碼553個氨基酸,推導(dǎo)分子量為62.12 kDa,等電點為6.27。GPIB的cDNA全長為2110 bp,開放閱讀框也是1662bp,編碼553個氨基酸,推導(dǎo)分子量為62.22kDa,等電點為6.82。GPIA和GPIB氨基酸序列相似性為83％,序列中均含有異構(gòu)酶活性所必須的保守位點,其中Ser-159、Ser-209、Lys-210、Thr-211、Thr-214、Glu-357、Val

5、-514、Leu-516直接與磷酸底物作用,Glu-216、Arg-272、His-388、Lys-518穩(wěn)定整個催化活性中心結(jié)構(gòu)。二者均不含信號肽,但均含有潛在的糖基化位點。
　　鰱魚GPI的二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲。用同源建模法分析鰱魚GPI三級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)鰱魚GPI單體含有兩個結(jié)構(gòu)域,二者結(jié)構(gòu)相似,都含有一個β折疊構(gòu)成的中心,由α螺旋和無規(guī)則卷曲包裹,α-20和α-21構(gòu)成一個鉤子結(jié)構(gòu),C末端形成臂結(jié)構(gòu),這兩

6、種結(jié)構(gòu)均有利于GPI與相鄰的單體形成二聚體。GPI二聚體由兩個亞基以非對稱的方式團(tuán)抱,各亞基延伸出的鉤子及臂結(jié)構(gòu)會環(huán)抱住另一亞基,這種“互相擁抱”的結(jié)構(gòu)增進(jìn)了GPI二聚體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
　　系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)硬骨魚中含有兩種GPI基因,其他脊椎動物都只含有一種GPI基因,在硬骨魚中GPIA和GPIB又各自形成分支,因此可以認(rèn)為GPI的基因分化晚于四足動物與鰭魚的分化,但早于硬骨魚的形成時期。
　　熒光定量PCR結(jié)果顯示GPIA