櫟精對葡萄糖-6-磷酸酶基因表達和活性的影響.pdf

1、目的：葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-Pase)是糖代謝過程中一個重要的酶，由于它是糖異生和糖原分解的最后一步反應(yīng)的限速酶，因此其基因表達水平及活性的變化直接影響到內(nèi)生性糖的輸出。事實上，2型糖尿病的高血糖同肝臟胰島素抵抗所致肝糖過度輸出有著緊密的關(guān)系。因此G-6-Pase是糖尿病治療的一個潛在靶點。本實驗旨在研究櫟精，G-6-Pase的一種新型抑制劑，對該酶基因表達和活性的影響，為進一步探討利用

2、該酶的抑制劑作為糖尿病的治療手段提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 方法：以膠原酶原位灌注消化的方法分離大鼠肝細胞，用含10％FBS的1640培養(yǎng)液進行原代培養(yǎng)，利用抗大鼠CK-18作為一抗，采用免疫組化方法對細胞進行鑒定。待細胞貼壁換用新鮮的含誘導劑和不同濃度抑制劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時后：1)提取細胞總RNA，采用半定量RT-PCR的方法測定G-6-pase兩個亞基的mRNA的豐度；2)利用葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)測定酶的活性。 結(jié)

3、果：1.采用以膠原酶原位灌注消化的方法分離的肝細胞產(chǎn)率及活率均比較高。細胞活率可達到85％以上。 2.免疫組化染色結(jié)果呈陽性著色(有陰性對照)。 3.大鼠肝細胞在高糖培養(yǎng)液(25mMGlu)中培養(yǎng)16小時后，G-6-Pase催化亞基和轉(zhuǎn)運亞基mRNA的豐度和酶活性均明顯增加。(P＜0.05)4.加入不同濃度的櫟精與高糖聯(lián)合培養(yǎng)16小時后，G-6-Pase的兩個亞基的mRNA的豐度均下降(P＜0.05)，但沒有呈現(xiàn)劑量依賴

4、性的變化。 5.酶活性測定的結(jié)果與基因水平的結(jié)果相一致，加入櫟精后，酶活性下降(P＜0.05)。 結(jié)論：利用膠原酶消化分離的肝細胞具有良好的產(chǎn)率及活率。原代肝細胞在高糖(25mM)狀態(tài)下培養(yǎng)，G-6-Pase的兩個主要的組成部分P36和P46均出現(xiàn)不同程度的高表達，這與最初的實驗設(shè)計相吻合，成功的模擬了體內(nèi)的高糖環(huán)境所產(chǎn)生的影響。不同濃度的櫟精可抑制高糖狀態(tài)下P36和P46的基因轉(zhuǎn)錄，但不同劑量組之間并沒有統(tǒng)計學意義，這