枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆及表達初步分析.pdf

1、枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）是薔薇科蘋果亞科枇杷屬植物，原產(chǎn)于中國。枇杷果實種子多并且種子相對較大，約占果實總重量的20％-30%，平均單果含有3-5粒種子，既影響食用的方便性，又不利于加工處置。因此無籽枇杷培育是枇杷育種的重要目標之一。赤霉素是一種重要的植物激素，不僅參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，還可以提高枇杷果實座果率。本研究以大五星二倍體及其三倍體A322株系為研究對象，測定了枇杷果實早期發(fā)育過程10種植物

2、激素的含量變化，采用同源基因克隆法克隆了枇杷赤霉素合成途徑中6個關(guān)鍵酶基因：GA20ox1，GA20ox2、GA3ox，GA2ox，CYP714A和CYP714C，并分析了這些關(guān)鍵酶基因在二倍體及三倍體枇杷A322株系果實早期發(fā)育中的表達特點。旨在從激素水平和分子水平探討赤霉素處理提高枇杷果實座果率的分子機理，為無籽枇杷生產(chǎn)提供科學依據(jù)，主要試驗結(jié)果如下：
　　1.枇杷果實發(fā)育期10種植物激素的測定
　?。?）以大五星和A3

3、22三倍體枇杷花和幼果為研究材料，建立了一套可同時分離和測定玉米素（ZT）、赤霉素（GA3）、激動素（KT）、水楊酸（SA）、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、苯甲酸（BA）、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、吲哚丁酸（IBA）和茉莉酸（JA）10種植物激素方法。在以甲醇：乙腈：磷酸緩沖液（pH=3.0）體積比為20：20：60為流動相，流速為1 mL/min，柱溫35℃，波長為210 nm和254 nm的條件下，測定枇杷幼果中10種激

4、素，其線性相關(guān)系數(shù)在0.9915以上，加標回收率在58.6%-85.2%之間；檢測限在0.004-4.92 ng之間，精密度在0.026%-3.05%之間。此外，采用番茄和甘藍葉片對方法進行了驗證。
　　（2）枇杷果實發(fā)育過程中赤霉素（GA3）和水楊酸（SA）的含量較其他植物激素高；此外，在二倍體和三倍體中ABA均有兩個明顯的峰值，與落果時間一致。
　　2.枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆
　?。?）GA20ox1基

5、因cDNA序列全長1083bp，與蘋果GA20ox1（XM_008344743）相似性為99%；GA20ox2基因cDNA片段長1122bp，與蘋果GA20ox2（LOC103439689）相似性為98%；GA3ox基因cDNA片段長931bp，與梨GA3ox（LC013247.1）相似性為98%，與蘋果GA3ox1（LOC103429342）相似性為98%；GA2ox基因cDNA全長904bp，與梨GA2ox1（LOC10395733

6、2）相似性為98%；CYP714A基因cDNA片段長797bp，與蘋果 CYP714A1（LOC103438620）相似性為99%；CYP714C基因cDNA全長692bp，與蘋果CYP714C2（LOC103417797）相似性為97%，與梨CYP714C2（LOC103946398）相似性為96%。
　?。?）以同源基因克隆法得到的cDNA序列與本實驗室枇杷轉(zhuǎn)錄組測序拼裝的核酸數(shù)據(jù)庫進行本地blast分析，得到了3個目的基因c

7、DNA全長序列和3個目的基因cDNA片段。3個全長序列的cDNA目的基因分別為：GA20ox1、GA2ox和CYP714C；3個序列片段的cDNA目的基因分別為：GA20ox2、GA3ox和CYP714A。
　　3.枇杷赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達特性分析
　　根據(jù)激素測定結(jié)果選取大五星和A322株系開花當天（0d）和100 mg/L GA3、清水（含0.1%吐溫-80）和無處理后1d、3d、5d、15d、25d和30d各時

8、期的材料，qRT-PCR分析表明，赤霉素代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達變化較大的為GA20ox1和GA3ox基因，其他基因表達變化不大。二倍體大五星GA20ox1基因表達GA3處理后30d表達量最高，處理后5d表達量最低。三倍體A322 GA20ox1基因表達開花當天表達量最高，此后1d至30d變化平穩(wěn)，30d增加不顯著。GA3ox基因在二倍體大五星中比在三倍體A322中表達變化較大。在大五星中，赤霉素處理后1d，達到最大值，此后表達量下降；在