阿霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的異源表達.pdf

1、阿霉素具有強烈的生物化學(xué)效應(yīng)，是臨床上的一種重要抗腫瘤藥物。阿霉素可由Streptomyces peucetius ATCC27952天然微量合成;傳統(tǒng)的化學(xué)法大規(guī)模合成阿霉素因其成本高、污染環(huán)境等缺點而制約了該藥的生產(chǎn)。阿霉素高產(chǎn)菌株的篩選一直是該藥生物合成法的研究熱點。在這些研究中，基因工程則表現(xiàn)出良好前景，特別是近年來合成生物學(xué)的快速發(fā)展。本研究則指向阿霉素關(guān)鍵酶基因的異源表達，以期實現(xiàn)阿霉素代謝通路的異源化構(gòu)建，進一步實現(xiàn)阿霉素

2、的異源菌株的從頭合成。具體內(nèi)容包括:
　　1、針對阿霉素生物途徑長、涉及關(guān)鍵酶基因繁多，以商業(yè)化的pET-28a載體為基礎(chǔ)，將該載體的T7啟動子前的XbaⅠ酶切位點失活，并在其后面加一個XbaⅠ酶切位點;在T7終止子后加一個SpeⅠ酶切位點。構(gòu)建出多基因串聯(lián)共表達載體，并命名為pBD，方便后續(xù)多基因的共表達;
　　2、利用基因組提取試劑盒提取了S.peucetius基因組，用PCR克隆技術(shù)克隆并構(gòu)建阿霉素合成關(guān)鍵酶基因的T載

3、體，然后構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株，實現(xiàn)異源表達?？寺×税⒚顾靥烊缓铣赏緩街胸撠?zé)成鏈、成環(huán)以及成環(huán)后糖基化及其修飾基因共16個，依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、dnrG、dpsY、dnrC、dnrD、dnrE、dnrF、doxA、dnrK、dnrP，表達了成鏈過程中關(guān)鍵酶基因依次為dpsA、dpsB、dpsC、dpsD、dpsE、dpsF、dpsG、dnrG、dpsY,

4、其中dpsA、dpsC、dpsE、dpsF、dpsY、dnrG正常表達。
　　3、考慮到外源基因過表達往往降低工程菌的生物量，而生物量的積累往往會促進產(chǎn)量的提高;而大腸桿菌與克雷伯氏菌(Klebsiella.AA405)遺傳背景非常相似，研究了Klebsiella.AA405自身生長基因的過表達對甘油代謝途徑中1，3-丙二醇、2，3-丁二醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與攜帶空質(zhì)粒重組菌相比，過表達編碼核糖ABC轉(zhuǎn)運酶的rbsC基因工程菌