通過異源表達(dá)發(fā)掘新穎安莎霉素的初步探索.pdf

1、放線菌是一類具有復(fù)雜生活史的革蘭氏陽性細(xì)菌，產(chǎn)生了目前已知的50％以上的抗生素。放線菌主要分布在陸地和海洋，極端環(huán)境和植物組織內(nèi)部也成為新的放線菌資源的重要來源。
　　安莎霉素是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的抗生素，這一類化合物通常具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌和抗病毒活性，主要分布在放線菌中，其中一個子類maytansinoids也存在高等植物和苔蘚中。安莎霉素屬于Ⅰ性聚酮類化合物，具有共同的生物合成起始單元AHBA(3-氨基-5-羥基苯甲酸)

2、，特異的AHBA合酶基因探針可以用于安莎霉素生物合成基因簇的篩選。安莎霉素的生物合成除了受細(xì)胞中次級代謝的全局調(diào)控因子的調(diào)控外，很多安莎基因簇中存在LuxR家族的途徑特異性正調(diào)控因子，因此可以通過對LuxR調(diào)控因子進(jìn)行過表達(dá)來激活沉默的基因簇或提高抗生素產(chǎn)量。
　　天然產(chǎn)物是最重要的藥物來源，也是尋找新的安莎類抗生素的巨大寶庫。宏基因組技術(shù)的興起為尋找蘊(yùn)藏在天然產(chǎn)物中的藥物資源提供了有力支持。
　　本論文嘗試從兩個方面發(fā)掘新

3、的安莎類抗生素。
　　第一種是構(gòu)建BAC文庫，希望能夠一次性獲得較大的完整的安莎類生物合成基因簇。首先構(gòu)建了一系列各具特色的E.coli-Strptomycets穿梭載體，其中pCCESAC82載體具有以下優(yōu)點:誘導(dǎo)型復(fù)制子，紅霉素強(qiáng)啟動子，支持BstXI的接頭連接，蔗糖致死基因sacB可降低空載率，CIS元件支持向鏈霉菌中的接合轉(zhuǎn)移和染色體整合。探索了構(gòu)建鏈霉菌BAC文庫的方法，從如何提取高質(zhì)量的HMW DNA(high mol

4、ecular weight DNA)，提高連接效率，制備超高效電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞和提高轉(zhuǎn)化效率等方面進(jìn)行了方法學(xué)探索。構(gòu)建了Actinosynnemapretiosum31565的BAC文庫，獲得了超過100 kb插入片段的克隆。
　　第二種是利用Red重組方法拼接重疊的不完整基因簇，在大腸桿菌中進(jìn)行基因調(diào)控后轉(zhuǎn)入合適宿主中異源表達(dá)。利用構(gòu)建的pCCESAC2載體和fosmid載體pCC1FOS的兩段同源區(qū)以及兩段基因簇插入片段之間的

5、一段同源區(qū)，進(jìn)行兩輪Red重組，將完整的生物合成基因簇成功捕獲到穿梭載體pCCESAC2上。創(chuàng)立了將插入在fosmid載體上的不完整基因簇進(jìn)行拼接的簡便方法。該方法較已經(jīng)報道的方法步驟簡化，不需要對載體進(jìn)行額外操作，不需要體外的基因操作創(chuàng)建同源臂和篩選標(biāo)記，獲得的完整基因簇不需要從載體上切下和重新連接，可以直接通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入宿主中進(jìn)行異源表達(dá)。利用該方法，成功拼接了滑桃樹宏基因組來源的新的五酮安莎類生物合成基因簇tam，還實現(xiàn)了三個重