CaMKⅡα蛋白的異源表達及與納米材料相互作用的初步研究.pdf

1、納米材料進入生物體后，會接觸上千種蛋白，引起多種生物學效應甚至產生毒性，其原因主要是納米材料與體內細胞、蛋白質等相互作用。納米材料與蛋白質結合后會對其構型、活性和穩(wěn)定性等產生影響，進而改變蛋白結構和功能。富勒烯納米晶體具有獨特的三維共軛結構和物理化學性質，因此在醫(yī)學和生物學領域中極具潛力，其應用包括DNA的光剪切、酶抑制作用、腫瘤治療、藥物載體、抗菌和細胞保護等。
　　研究已表明富勒烯納米晶體（C60）具有與N-甲基D-天冬氨酸（

2、NMDA）受體NR2B亞基相似的功能，通過與鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα（CaMKⅡα）發(fā)生特異、穩(wěn)定性相互作用，從而將其鎖定在活化狀態(tài)，引發(fā)特定信號傳遞，促進學習與記憶過程。研究納米材料與蛋白質相互作用，將有助于全面了解其作用機理，同時也為其開發(fā)新的醫(yī)學應用及安全性設計提供了重要的理論依據。
　　本論文主要分為兩個部分：
　　（1）為了提高表達量，將CaMKⅡα蛋白在不同標簽的載體中進行融合表達，并對表達條件進行優(yōu)化

3、。結果表明在pET22b載體中，菌種按0.1％接種量，加入0.2 mM IPTG，在16℃條件下誘導16 h表達效果最好。隨后通過親和層析、分子篩等純化操作，以其獲得可溶性的目的蛋白，為后續(xù)實驗提供足夠樣品。
　?。?）通過溶劑置換法制備了C60水懸液，并用UV、DLS對其進行了表征。利用Langmiur平衡吸附等溫模型考察了1μg C60可最大結合5.435μg CaMKⅡα蛋白。DLS結果顯示納米晶體吸附蛋白后以單體形式為主，

4、僅有少量的團聚體。隨后在模擬生理條件下，利用光譜實驗和分子模擬技術研究了不同溫度下C60與CaMKⅡα相互作用結合參數。結果如下：
　　根據熒光猝滅原理判斷猝滅機制為靜態(tài)猝滅，并得出在298 K，310 K和318K三個不同溫度下的結合常數分別為4.87×105，6.47×105，7.65×105 L·mol-1。通過計算熱力學參數，焓變ΔH為正值（209.805 kJ/mol），熵變ΔS為正值（778.364 J/mol/K）。

5、由此推斷 C60與CaMKⅡα結合是靠疏水作用進行的自發(fā)反應，與分子模擬結果一致。分子模擬研究進一步表明，C60主要以π-π鍵形式和蛋白分子中芳香族或帶電殘基結合，是對熱力學實驗很好的補充。紫外光譜和同步熒光光譜結果說明C60可以引起蛋白疏水腔中Trp殘基周圍微環(huán)境的疏水性降低，極性增加。此外，根據圓二色譜的擬合數據，定量計算了蛋白分子二級結構，表明C60對蛋白二級結構沒有顯著的影響，僅使α-螺旋降低了1.8%，β-折疊升高了1.1%。