具有安莎產(chǎn)生潛能放線菌的篩選及小單孢菌中安莎基因簇的克隆.pdf

1、安莎類抗生素是一類主要由放線菌產(chǎn)生的，結(jié)構(gòu)獨(dú)特、具有廣泛生理活性的Ⅰ型聚酮類大環(huán)內(nèi)酰胺。其生物合成起始單元是3-氨基-5-羥基苯甲酸(3-amino-5-hydroxy benzoic acid，AHBA)。AHBA通過(guò)莽草酸途徑的分支途徑氨基莽草酸途徑合成，其中催化最后一步反應(yīng)的AHBA合酶基因有較高的保守性和特異性，很早就被用作探針篩選安莎霉素的生物合成基因簇。為了尋找新安莎類抗生素，本研究以AHBA合酶基因?yàn)楹Y選目標(biāo)，通過(guò)多輪PC

2、R并反復(fù)驗(yàn)證，從350株放線菌（主要是小單孢菌）中篩選到10株AHBA合酶基因陽(yáng)性菌株，經(jīng)過(guò)16S rDNA鑒定，全部為小單孢菌。
　　 選取AHBA合酶基因分歧較大的NS0172，NS0208，F(xiàn)XY411，F(xiàn)XYA29,HK160111分別構(gòu)建Fosmid基因組文庫(kù)，以AHBA合酶基因?yàn)樘结樅Y選Fosmid文庫(kù)，通過(guò)步移篩選，從每個(gè)文庫(kù)中得到幾個(gè)可能與安莎霉素合成相關(guān)的重疊克隆。通過(guò)454高通量測(cè)序?qū)﹃?yáng)性fosmid進(jìn)行測(cè)序

3、，結(jié)合隨機(jī)亞克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到5個(gè)基因簇序列；運(yùn)用生物信息學(xué)的手段對(duì)基因簇序列進(jìn)行了開放閱讀框的預(yù)測(cè)和功能推測(cè)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因簇中都含有AHBA合成相關(guān)基因、PKS基因。其中NS0172菌株中的基因簇Nam以及HK160111中的基因簇Ham含有AHBA合成所需所有基因，完整的PKS基因和酰胺合酶基因，初步推斷這兩個(gè)基因簇合成5酮安莎霉素。另外三個(gè)基因簇都不完整，但相互之間相似性很高，且與Micromonospora sp.L5中

4、的一個(gè)基因簇非常相似，很可能合成同類化合物。
　　 為了研究酰胺合酶的體外功能，我們還將兩個(gè)不同基因簇來(lái)源的酰胺合酶基因natF和tam15在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)。通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化，獲得了可溶性蛋白，為研究酰胺合酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、探究酰胺合酶催化聚酮鏈的釋放和酰胺鍵形成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)基因水平的篩選獲得潛在的安莎霉素產(chǎn)生菌，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，可以快速高通量地獲得潛在的安莎霉素合成基因簇，根據(jù)序列推測(cè)所