紅樹林放線菌的分離及其功能基因篩選.pdf

1、紅樹林是自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,是海洋向陸地的過渡帶,有著豐富的微生物資源。長期生存于濕潤、高鹽、強(qiáng)酸性的特殊環(huán)境的紅樹林放線菌具有復(fù)雜獨(dú)特的代謝途徑,形成了獨(dú)特的分子適應(yīng)機(jī)制,具備產(chǎn)生新穎獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛能。因此研究紅樹林土壤樣品的放線菌組成、功能基因的篩選有重大理論實(shí)踐意義。
　　 本文主要對(duì)廣東紅樹林土壤樣品采取干熱法和濕熱法兩種不同預(yù)處理方式,并采用高氏一號(hào)、改良高氏二號(hào)和腐殖酸培養(yǎng)基(HV

2、A)三種選擇性培養(yǎng)基,分別添加制霉菌素和萘啶酮酸兩種抑制劑,對(duì)這些樣品進(jìn)行分離,共分離得到96株海洋放線菌菌株。用顯微鏡觀察和菌落形態(tài)觀察對(duì)分離到的放線菌進(jìn)行初步歸類,可將96株菌分為7個(gè)類群:灰褐類群、燼灰類群、淡紫灰類群、粉紅孢類群、粉紅紫類群、白孢類群和黃色類群。高氏一號(hào)培養(yǎng)基的分離效果最好,共得到46株具典型放線菌形態(tài)的菌株,占總數(shù)的47.9％,改良高氏二號(hào)培養(yǎng)基分離得到32株放線菌,為分離總數(shù)的33.3％,HVA培養(yǎng)基的分離效

3、果最差,得到18株放線菌,而且得到的類群也是最少的。菌株經(jīng)RFLP初步分型后,挑選部分菌株進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增分析,將序列結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示,分離到的海洋放線菌可歸為3個(gè)屬,多數(shù)放線菌分布在鏈霉菌屬的27個(gè)種當(dāng)中,并有1株菌為潛在鏈霉菌新種,1株可能為糖多孢菌屬新種,1株為潛在擬諾卡氏菌屬新種。
　　 對(duì)分離得到的96株海洋放線菌,分別采用K1F／M6R、A3F／A7R、Halo-F

4、W／Halo-RV三對(duì)兼并引物進(jìn)行Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ),非核糖體肽合成酶(NRPS)和鹵代酶功能基因擴(kuò)增,評(píng)估其合成活性次級(jí)產(chǎn)物的潛力。篩選結(jié)果表明,在96株海洋放線菌中,有36株含有Ⅰ型聚酮合酶功能基因,陽性率為37.5％,其中有6個(gè)PKS-Ⅰ氨基酸序列同源性比GENBANK數(shù)據(jù)庫中的已知Ⅰ型聚酮合酶序列的同源性低于70％；40株含有非核糖體肽合成酶基因,陽性率為41.7％,11株含有鹵代酶基因,陽性率為11.5％；挑選具有PK