紅樹林放線菌的多相分類鑒定及半纖維素酶類基因的克隆、表達.pdf

1、紅樹林是熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,其生境具有不同于海洋和陸地的性質(zhì),地下生態(tài)系統(tǒng)較之其他環(huán)境有很大的不同,蘊藏著巨大的微生物資源。生存于紅樹林土壤的放線菌,其次級代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)類型以及生物活性方面都呈現(xiàn)出與陸生放線菌不同的特點和多樣性,作為生物活性物質(zhì)來源也越來越受到重視。紅樹林枯枝落葉中含有大量的纖維素和木質(zhì)素,因此,有關(guān)真菌纖維素和木質(zhì)素分解酶的研究較多,但對放線菌產(chǎn)生的降解酶類的研究相對較少。 本文從漳州紅樹林自然保護

2、區(qū)的七個土壤樣品中,選用五種選擇性分離放線菌的培養(yǎng)基,共分離得到放線菌286株,但分離的放線菌中90％為鏈霉菌屬的菌株。通過16SrDNA序列的同源性比較發(fā)現(xiàn)了其中有三株潛在的鏈霉菌屬的新種,運用現(xiàn)代多相分類鑒定研究方法,對潛在新種進行了形態(tài)學(xué),生理生化特征,化學(xué)分類特征及分子分類的鑒定,確定了三株鏈霉菌的分類地位,并將其中一株鏈霉菌MGR035命名為廈門鏈霉菌(Streptomyces xiamenensis sp.nov.)作為鏈霉

3、菌屬的新種進行了描述。 通過采用含有纖維素、半纖維素的篩選平板對分離得到的152株放線菌進行了產(chǎn)酶菌株的初篩,發(fā)現(xiàn)有50％的菌株對纖維素、半纖維素有不同程度的降解能力,有9株鏈霉菌的酶活性較高。對其中三株菌株的酶活特性進行了初步測定,發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)的纖維素、半纖維素酶均屬中溫、中性酶,酶反應(yīng)最適溫度在50-60℃、最適pH值為6-7。本實驗設(shè)計了兩對兼并引物,PCR擴增獲得了兩株高產(chǎn)酶鏈霉菌的半纖維素酶核心區(qū)序列,利用反向PCR技術(shù)克

4、隆得到了菌株Streptomyces sp.zxy19和Streptomyces sp.s6-204的230個氨基酸的木聚糖酶和530個氨基酸的甘露聚糖酶基因,分別與糖基水解酶家族11和5的成員具有約80％的氨基酸序列同源性。隨后構(gòu)建了酶基因在大腸桿菌中的原核表達載體,實現(xiàn)了重組酶基因的可溶性表達,并進行了酶活性的檢測。初步實驗發(fā)現(xiàn)克隆的甘露聚糖酶基因氨基酸序列與同一酶家族的其它酶基因氨基酸序列相比,其開放閱讀框N端多出100個氨基酸,