未培養(yǎng)微生物纖維素酶基因的克隆、鑒定和表達.pdf

1、該研究通過利用polyvinylpolypyrrolidone+Sephadex G200層析柱與電透析兩步純化的方法成功地純化了來自土壤和堆肥樣品的DNA.所純化的DNA可以進行限制性內(nèi)切酶酶切、PCR、連接、轉化.純化過程對DNA的物理打斷作用非常小,所得到的DNA片段大小能滿足Cosmid文庫構建的需要.所提取純化的總DNA經(jīng)擴增16srDNA進行序列比對證明具有微生物種群的多樣性.利用土壤樣品建立了一個metagenomic D

2、NACosmid library(TD1),共有5萬個克隆,庫容量為1.84×109 bp.利用堆肥樣品建立了一個metagenomic DNA Cosmidlibrary(DU1),共有10萬個克隆,庫容量為3.4×109 bp.從DU1中篩選到四個具有CMCase活性的克隆.選取其中兩個利用轉座缺失的方法進行亞克隆.用Primer Walking的策略測定兩個克隆所攜帶的CMCase基因序列(umcel9A基因和umcel9B基因)

3、.經(jīng)檢索NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫,umcel9A基因與Xanthomonas campestrispv.campestris的endo-1,4-beta-D-glucanase基因的氨基酸相似性最高,為54％;Umcel9B基因與Microbulbifer degradans 2-40的一種假定的蛋白的基因的氨基酸相似性最高,為48%.經(jīng)用SMART工具分析umcel9A和umcel9B基因的翻譯產(chǎn)物,它們都具有家族9的糖基水解酶

4、功能域.把umcel9A基因和umcel9B基因分別用PCR的方法擴增克隆到表達載體pQE30和pQE32,實現(xiàn)了兩個基因在大腸桿菌中的表達,但是umcel9A基因的大部分表達產(chǎn)物形成了包涵體,umcel9B基因的表達產(chǎn)物是可溶性蛋白.Umcel9A與umcel9B蛋白質(zhì)都得到了純化,從它們的酶學特性分析表明雖然兩種蛋白質(zhì)屬于同一個家族的水解酶,但是他們的酶學特性相差很大.Umcel9A的最適pH值為6.6,最適溫度為40℃,Km為1,