未培養(yǎng)微生物預(yù)苯酸脫氫酶基因的克隆、表達和功能鑒定.pdf

1、預(yù)苯酸脫氫酶(EC1.3.1.12)以NAD(P)+為輔酶催化預(yù)苯酸氧化脫羧生成對羥基苯丙酮酸，在L-酪氨酸的生物合成代謝中起關(guān)鍵作用。目前國際上有關(guān)預(yù)苯酸脫氫酶的研究主要集中在對來自于Aquifex aeolicus、Streptococcus mutans和Haemophilus influenzae等細菌的預(yù)苯酸脫氫酶的功能和結(jié)構(gòu)研究，鮮見有關(guān)來自于環(huán)境未培養(yǎng)微生物的新型預(yù)苯酸脫氫酶的研究。
　　 本研究采用基于序列特異性

2、直接測序的策略，篩選本課題組前期構(gòu)建的堿性污染土壤樣品宏基因組文庫AL01，發(fā)現(xiàn)陽性克隆pGXAL10028所攜帶的外源DNA片段中可能包含一個編碼預(yù)苯酸脫氫酶的新基因，將其命名為pdhE。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：基因pdhE由609個堿基對組成，編碼具有一個具有203個氨基酸殘基的多肽；其相對分子質(zhì)量約為22.3 kDa，理論等電點為5.31。在DNA水平上，pdhE與一個來自于Novosphingobiumsp.PPIY的全基因組測

3、序注釋為預(yù)苯酸脫氫酶編碼基因(GenBank登錄號：FR856862.1)的一致性最高，為82%；在氨基酸水平上，PdhE與一個來自于Zymomonas mobilis的預(yù)苯酸脫氫酶(GenBank登錄號：Q04983.2)的相似性最高，相似性為65%，一致性為42%。
　　 采用pETBlueTM系統(tǒng)構(gòu)建了包含pdhE基因的重組表達克隆，采用鎳柱親和層析技術(shù)純化得到了重組蛋白PdhE。基因的功能鑒定實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白PdhE

4、沒有預(yù)苯酸脫氫酶的催化活性。結(jié)合簡單組件結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，初步推測預(yù)苯酸脫氫酶的氨基末端的Rossmannβ-α-β fold結(jié)構(gòu)是預(yù)苯酸脫氫酶的體現(xiàn)催化活性時的必需關(guān)鍵組件，其作用可能是幫助輔酶在活性中心定位。
　　 基于序列多重序列分析比較結(jié)果，采用融合PCR技術(shù)，將大腸桿菌K-12菌株中編碼預(yù)苯酸脫氫酶的“Rossmannβ-α-β fold”保守結(jié)構(gòu)的DNA與pdhE融合，得到一個新的融合基因，將其命名為pdhE-1。采用p

5、ETBlueTM表達系統(tǒng)表達pdhE-1，并使用鎳柱親和層析技術(shù)分離純化得到了重組蛋白PdhE-1?；虻墓δ荑b定實驗結(jié)果表明重組蛋白PdhE-1恢復(fù)了預(yù)苯酸脫氫酶活性。生化性質(zhì)分析實驗結(jié)果表明，以預(yù)苯酸為底物，重組蛋白PdhE-1的最適反應(yīng)溫度為45℃，最適反應(yīng)pH為8.0；重組蛋白PdhE-1的比活力為7.63 U/mg。動力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果表明，重組蛋白PdhE-1的表觀米氏常數(shù)Km為0.87mmol/L，催化常數(shù)kcat為10.0