中國牦牛瘤胃未培養(yǎng)微生物來源的纖維素降解酶的篩選、克隆和鑒定.pdf

1、纖維素是世界上儲量最豐富的可再生資源,為發(fā)展可再生生物燃料的提供了無盡的原料,但纖維素的糖化卻一直是其利用過程中的瓶頸。為了尋找新型、高效的纖維素酶,本研究對中國牦牛瘤胃微生物纖維素降解酶資源進行了探索。瘤胃樣本細菌菌群分析顯示,66.8％的細菌分布于硬壁菌門(Firmicutes)和27.9%的細菌分布于擬桿菌門(Bacteroidetes)。該樣本中約10%的細菌為已知菌,包括了典型的瘤胃纖維素降解菌Ruminococcus alb

2、us,Butyrivibrio fibrisolvens和Fibrobacter succinogenes。其余約90%的細菌是不可培養(yǎng)微生物,其中很大一部分落入Ruminococcaceae科,Lachnospiraceae科和Prevotellaceae科,且與已知的瘤胃纖維素降解菌聚類在一起,提示它們可能為新型的不可培養(yǎng)纖維素降解菌。對其中的真菌菌群分析顯示真菌含量約只有細菌的1%,含有具有纖維素降解能力的真菌Orpinomyce

3、s sp.。所以該瘤胃樣本不僅含有已知纖維素降解菌,還可能含有許多不可培養(yǎng)的纖維素降解菌,提示了從中克隆到纖維素酶的高可能性?；谠摿鑫笜颖局写蟛糠治⑸锸遣豢膳囵B(yǎng)的,我們使用宏基因組技術構建了中國牦牛瘤胃微生物的宏基因組文庫,并對其進行功能篩選,獲得了內(nèi)切葡聚糖酶陽性克隆5個、外切葡聚糖酶陽性克隆24個、葡萄糖苷酶陽性克隆50個木糖苷酶陽性克隆27個和木聚糖酶陽性克隆6個。隨后克隆和鑒定了其中的三個酶RuBGX2、RuBGX3和Ruc

4、e15B。RuBGX2和RuBGX3均既有p-葡萄糖苷酶活性,又有p-木糖苷酶活性,屬于糖苷水解酶家族3,具有48.9%的氨基酸序列一致性。他們的最適反應pH約為5左右,最適反應溫度約為40℃,且對于p構型的糖苷底物均具有一定的廣譜性,同時它既能水解纖維寡糖類底物,又能水解多種人工芳香基衍生底物。RuBGX2可水解聚合度為2、3、4的纖維寡糖,RuBGX3僅能水解聚合度為2、3的纖維寡糖。RuBGX2對1%的纖維二糖的轉(zhuǎn)化率高達98.3

5、%,對1%纖維四糖的轉(zhuǎn)化率高達80%。RuBGX2和RuBGX3的β-葡萄糖苷酶活性使得他們可以降低纖維素水解中間產(chǎn)物的抑制作用來促進纖維素的水解,而β-木糖苷酶活性使得他們可以通過與木聚糖酶的協(xié)同作用來來促進半纖維素的水解。同源建模和分子對接結(jié)果顯示RuBGX2和RuBGX3的β-葡萄糖苷酶活性和p-本糖苷酶活性來自于同一個活性中心,說明這兩種活性是由底物的廣譜特異性引起的。Rucel5B既有內(nèi)切葡聚糖酶活性,又有外切葡聚糖酶活性,屬

6、于糖苷水解酶家族5。它的內(nèi)切葡聚糖酶活性高達219.7U/mg,外切葡聚糖酶活性高達52.9U/mg。Ruce15B的最適溫度約60℃,在55℃處理1h后不喪失酶活,說明它具有比較高的熱穩(wěn)定性。底物特異性分析結(jié)果顯示Ruce15B能夠水解β-1,4葡萄糖苷鍵,但是不能水解β-1,3葡萄糖苷鍵β-1,6葡萄糖苷鍵和β-1,4木糖苷鍵,同時Ruce15B既能水解無定型纖維素(CMC,barleyglucan,lichenan,PASC),又

7、能水解晶體纖維素(微晶纖維素和濾紙avicel,filterpaper)。進一步對Ruce15B的水解產(chǎn)物進行了色譜分析,結(jié)果顯示它能從MuC的非還原端切割下纖維二糖,能夠水解纖維四糖,avicel,filterpaper和PASC并釋放纖維二糖,說明了他的外切作用模式。而對可溶性無定型纖維素(CMC,barleyglucan,lichenan)時間梯度降解結(jié)果顯示在反應的開始階段,產(chǎn)物的聚合度明顯降低,提示Ruce15B具有內(nèi)切的作用

8、模式。綜上,本研究分析了牦牛瘤胃樣本中微生物的多樣性,建立了宏基因組文庫功能篩選纖維素酶的平臺,克隆并鑒定了兩個β-葡萄糖苷酶/木糖苷酶RuBGX2和RuBGX3,和內(nèi)切/外切葡聚糖酶Ruce15B。RuBGX2和RuBGX3不僅顯示了葡萄糖苷酶和木糖苷酶兩種活性,還顯示了對纖維寡糖的高轉(zhuǎn)化率和與木聚糖酶的協(xié)同作用;Ruce15B則顯示出纖維素內(nèi)切和外切作用模式,以及高活性和熱穩(wěn)定性的特質(zhì)。這些研究結(jié)果都說明了瘤胃是新型纖維素降解酶的很