分解纖維素的微生物的分離(2.25)

1、目標(biāo):,1、知道纖維素酶的種類及作用,2、初步掌握從土壤中分離出分解纖維素的微生物的實(shí)驗方法,㈠纖維素與纖維素酶,1.纖維素,一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。,一、基礎(chǔ)知識,植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。,思考：纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，但卻不會在地球上大量的積累，為什么？,纖維素能被土壤中某些微生物分

2、解利用，這是因為它們能夠產(chǎn)生纖維素酶。,土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。,在草食性動物的消化道內(nèi)，共生有分解纖維素的微生物，其產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素。 人沒有分解纖維素的能力。,人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。,草食性動物是怎樣消化纖維素的？,下列生物能分解纖維素的是（ ） ①人 ②兔 ③牛 ④蘑菇 ⑤纖維桿菌,A.①②③④⑤

3、 B.②③⑤,C.②③④⑤ D.③⑤,C,即：能分解纖維素的微生物有各種細(xì)菌、真菌和少數(shù)放線菌，動物則為草食性動物。,2.纖維素酶 一種復(fù)合酶，它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。,①取二支20mL的試管,實(shí)驗：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗,②各加入一張濾紙條,③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml,甲 乙,④在乙試管中加入1mL纖維素酶,⑤兩支試

4、管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h,⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失,討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？,自變量：纖維素酶的有無自變量的控制： 乙試管--1mL纖維素酶溶液 甲試管--等量的緩沖液(不能加蒸餾水，會影響溶液的pH)。,實(shí)驗分析：P27的小實(shí)驗是如何構(gòu)成對照？,（二）纖維素分解菌的篩選,1、篩選纖維素分解菌的方法是______________。該方法可以通過________反

5、應(yīng)直接篩選。,剛果紅染色法,顏色,2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被_________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_____________為中心的________，我們可以通過____________來篩選纖維素分解菌。,紅色復(fù)合物,纖維素酶,纖維素分解菌,透明圈,是否產(chǎn)生透明圈,練一練：,1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是,A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B. 纖維素酶可把纖維

6、素分解成葡萄糖C. 纖維素酶可用于去掉植物的細(xì)胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖,,2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是,A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩　選出了纖維素分解菌,,土壤取樣,選擇培養(yǎng),梯度稀釋,將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上,挑選產(chǎn)生透明圈的菌落,,,,

7、,實(shí)驗設(shè)計,①分布環(huán)境,1.土壤取樣：,富含纖維素的環(huán)境中,操作步驟,生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。,②原因,③實(shí)例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。,④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中。,將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的

8、土壤中。,2、選擇培養(yǎng),增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。,①目的：,②制備選擇培養(yǎng)基：,③操作：,將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。,在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。,為什么選擇培養(yǎng)能“濃縮”所需的

9、微生物？,培養(yǎng)基成分分析,提示：可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。,A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？,B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？是如何進(jìn)行選擇的？,C、你能否設(shè)計一個對照實(shí)驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用？,本實(shí)驗的流程與課題2中的實(shí)驗流程有哪些異同？,課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。 本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增

10、殖后，再將菌液涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。,思考：,說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。,將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上,將細(xì)菌培養(yǎng)在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上,固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基,篩選菌株,選擇培養(yǎng)，增加濃度,按照課題1的稀釋操作方法

11、，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101～107倍。,3.梯度稀釋,4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上 ⑴制備培養(yǎng)基:參照課本旁欄中的比例配制。 ⑵倒平板操作。 ⑶涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各 取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。 ⑷挑選產(chǎn)生透明圈的菌落(參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落,即為分解纖維素的菌落.),鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基,(水溶性羧甲基纖維素鈉

12、),,方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在 時就加入剛果紅。,培養(yǎng)微生物,倒平板,5.剛果紅染色法,挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。,這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？,顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用,操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜,操作簡便不存在菌落混雜問題,1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。,方法一中NaC

13、l溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。,在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅,剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈,觀察菌落周圍是否有紅色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌,觀

14、察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌,脲酶檢測法,剛果紅染色法,在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－ 370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。,6、純化培養(yǎng),四、結(jié)果分析與評價,1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 2.分離的結(jié)果是否一

15、致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。,為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行_____________實(shí)驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有______ 發(fā)酵和______ 發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________ 含量進(jìn)行定量測定。,發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶,液體,固體,葡萄糖,五、課題延

16、伸,分解纖維素的微生物的分離,纖維素酶,種類、作用、催化活力,剛果紅染色,篩選原理,實(shí)驗設(shè)計,土壤取樣,選擇培養(yǎng),涂布培養(yǎng),純化培養(yǎng),,,,,,,,,前置染色法后置染色法,,富含纖維素土壤,增大分解菌含量,染色鑒別,分離出分解菌,,,,,,課堂總結(jié),練一練,1、在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合下列哪一生物學(xué)觀點(diǎn)？（ ）A、生物結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)的觀點(diǎn) B、生物結(jié)構(gòu)與功能整體性觀點(diǎn)C、生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn)

17、 D、生物發(fā)展進(jìn)化的觀點(diǎn),2、從土壤中分離獲得某種微生物的步驟是（ ） ①土壤取樣 ②梯度稀釋 ③選擇培養(yǎng) ④菌懸液涂布平板 ⑤挑選出單個菌落A、 ①②③④⑤ B、①③②④⑤C、 ①②④③⑤ D、①④②③⑤,3、有關(guān)選擇培養(yǎng)正確的敘述是（ ）,A、可以增加纖維素分解菌的濃度B、可以減少纖維素分解

18、菌的濃度C、所用培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基D、所用培養(yǎng)基是平板培養(yǎng)基,C,B,A,11年39.【生物 選修1：生物技術(shù)實(shí)踐（15分）有些細(xì)菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從污染的土壤中篩選出高效降解原油的菌株。回答問題：⑴在篩選過程中，應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以 為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于 培養(yǎng)基。⑵純化菌種時，為了得到單菌落，常采用的接種

19、方法有兩種，即 和 。,石油,選擇,平板劃線法,稀釋涂布平板法,⑶為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍分解圈的大小，分解圈大說明該菌株的降解能力 。⑷通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中實(shí)驗室常用的滅菌方法有 、 和 。無菌技術(shù)要求試驗操作應(yīng)在酒精燈 附近進(jìn)行，以避免周圍環(huán)境中微生物的污染。,強(qiáng),灼燒滅菌,干熱滅菌法,高壓蒸汽滅菌法,火焰