牦牛瘤胃微生物元基因組BAC文庫的篩選與分析.pdf

1、反芻動物瘤胃是公認的木質(zhì)纖維素高效降解的天然反應器,對瘤胃微生物的研究成為開發(fā)生物能源的熱點領(lǐng)域之一。其研究手段已經(jīng)從傳統(tǒng)的依賴分離培養(yǎng)從瘤胃中獲得木質(zhì)纖維素降解菌,并對降解菌中的木質(zhì)纖維素降解酶逐一分析,發(fā)展到通過基因組/元基因組技術(shù),直接從瘤胃中發(fā)現(xiàn)獲得大量新的木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇,進而探討其降解的分子機理。元基因組BAC(Bacterialartificialchromosome)文庫,具有能夠容納大插入片段的優(yōu)勢,近幾年

2、來受到廣泛關(guān)注,通過構(gòu)建大片段的元基因組BAC文庫并對其進行篩選有可能獲得大量新的基因/基因簇。建立了木質(zhì)纖維素降解酶高通量篩選平臺,可在3種不同底物的篩選平板上一次完成96個克隆的脂肪酶、木聚糖酶、纖維素酶和酯酶的活性篩選。采用該方法從已構(gòu)建的牦牛瘤胃元基因組BAC文庫的9600個克隆中篩選獲得脂肪酶陽性克隆60個(0.625％),木聚糖酶陽性克隆123個(1.28%),纖維素酶陽性克隆156個(1.625%),酯酶陽性克隆101個(

3、1.05%);其中具有2種酶活性的克隆79個,3種酶活性的克隆11個,表明文庫中存在大量木質(zhì)纖維素降解酶基因/基因簇。對4個木聚糖酶陽性克隆的測序結(jié)果進行分析,發(fā)現(xiàn)存在多種糖苷水解酶基因和調(diào)控基因,還發(fā)現(xiàn)一個可能的新木聚糖酶基因簇。為驗證該基因簇的功能,對其中的部分基因在大腸桿菌中進行了克隆、表達、蛋白純化及酶活性測定,研究結(jié)果證實該基因簇的ORF33基因、ORF34基因分別編碼降解木聚糖主鏈的內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶/木糖苷酶,為進