森林紅壤微生物的功能生態(tài)學分析及宏基因組文庫構(gòu)建.pdf

1、經(jīng)濟適用的木質(zhì)纖維素水解工藝是實現(xiàn)纖維素乙醇商品化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究土壤中多樣性的木質(zhì)纖維素分解微生物及其酶基因資源，將為開發(fā)新型木質(zhì)纖維素水解酶系奠定基礎(chǔ)。本文通過對一系列不同環(huán)境不同來源的森林土壤的理化及生物酶活性分析，篩選出一組具有著良好木質(zhì)纖維素分解能力的酸性森林土壤樣品SD。提取樣品SD總基因組DNA為模板，用特異的16S rDNA及18S rDNA引物進行PCR擴增，構(gòu)建環(huán)境微生物的16S rDNA及18S rDNA基因文庫，

2、并對文庫進行RFLP分析(restriction fragment length polymorphism)、測序、序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。對該土壤細菌和真菌的菌群結(jié)構(gòu)及生態(tài)功能進行分析。結(jié)果表明，從挑取的112個克隆中一共鑒定出66個不同細菌類群，主要類群包括Acidobacteria(包含Gp1、Gp2、Gp3、Gp10以及Gp13等5個簇)，Proteobacteria(包含alpha，beta，delta和gamma四亞門)，

3、Verrucomicrobia和Unclassified Bacteria。其中，Acidobacteria是最大的類群，含有80個克隆，占總克隆數(shù)的71.5％：Proteobacteria次之，含有27個克隆，占總克隆數(shù)的24.1％。相對細菌來說，真菌菌群具有更為豐富的多樣性則，鑒定出的40個不同的真菌帶型包括6大類，即Ascomycota(36.2％)，Basidiomycota(42.8％)，Zygomycota(13.8％)，C

4、hytridiomycota(2.9％)和Fungi incertae sedis(4.3％)。其中Basidiomycota和Ascomycota是18S rDNA文庫克隆中的主要菌型，占總菌群的79％。分析表明SD土壤樣品中包含有豐富的木質(zhì)纖維素分解微生物，細菌有Syhingomonas和Burkholderia以及一些固氮細菌；真菌中包含有更多的參與木質(zhì)纖維素分解的微生物種類，主要包括擔子菌門的Tricholomataceae，S

5、trophariaceae和Agaricaceae；子囊菌門的Orbilia，Aspergillus，Phialocephala，Epicoccum，Phoma和Zygomycota的Mucorales等。 為了開發(fā)這些土壤微生物所蘊含的豐富的木質(zhì)纖維素分解酶基因資源，我們構(gòu)建了森林土壤的宏基因組文庫。通過對土壤樣品總基因組DNA大量抽提、剪切、濃縮，首先獲得適合文庫構(gòu)建的DNA。純化的基因組片段插入Cosmid粘粒，包裝，轉(zhuǎn)染

6、大腸桿菌宿主，構(gòu)建成功森林土壤宏基因組文庫。文庫包含約230000個克隆，隨機酶切和測序分析顯示，插入片段平均大小為35kb，總庫容為8.03 Gb。 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的木聚糖酶基因和漆酶基因的保守序列分別設(shè)計特異性引物，擴增獲得包含有漆酶基因保守區(qū)域長121bp的DNA片段，利用該片段對宏基因組文庫進行原位雜交篩選。同時通過高通量功能篩選方法對文庫進行了木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶等工業(yè)用酶的初步篩選，得到了35