山羊瘤胃微生物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及功能基因的篩選.pdf

1、自然界中存在著大量的微生物，能夠在實(shí)驗(yàn)室中純培養(yǎng)的種類微乎其微，這就大大限制了人們對(duì)微生物的研究。宏基因組學(xué)可以在非實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的條件下直接獲取環(huán)境微生物DNA，對(duì)其基因組進(jìn)行分析并將其克隆到合適的載體上，篩選所需要功能基因。為了研究山羊瘤胃微生物菌群降解纖維素酶的功能，本試驗(yàn)利用宏基因組學(xué)技術(shù)，從山羊瘤胃液中提取混合微生物DNA，經(jīng)BamHI部分酶切后得到50～800 kb的DNA片段，將其連接到pCC1 BAC載體上，轉(zhuǎn)化E. co

2、li EPI300，建立山羊瘤胃微生物BAC文庫(kù)，共獲得12672個(gè)克隆。用Not I酶切后，經(jīng)RFLP分析，該文庫(kù)平均插入片段為61 kb，獲得了0.7Gbp的基因組DNA覆蓋，具有較高的研究?jī)r(jià)值。以七葉苷為底物的檢測(cè)平板，進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的高通量功能篩選，獲得了16個(gè)β-葡萄糖苷酶陽(yáng)性克隆，對(duì)其中一個(gè)具有較高活力的陽(yáng)性克隆進(jìn)行深入分析，用Sau3A I對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行部分酶切后，回收2～5 kb之間片段進(jìn)行回收連接到pUC19載體上