野生稻基因組富集文庫的構(gòu)建及抗性基因篩選.pdf

1、野生稻中含有豐富的有利基因，是拓展栽培稻遺傳基礎(chǔ)的重要基因資源，但傳統(tǒng)雜交轉(zhuǎn)育種存在由于生殖隔離引起的諸多局限性，直接從野生稻中克隆有利基因也由于野生稻基因組背景知識的匿乏等因素而存在困難。本研究集成了候選抗性基因克隆技術(shù)和磁珠富集文庫技術(shù)以及可轉(zhuǎn)化基因組文庫技術(shù)，提出了基于候選抗性基因富集文庫克隆野生稻新抗性基因的策略。它包括構(gòu)建野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫，利用RecA重組蛋白介導(dǎo)生物素標記的探針對文庫進行磁珠富集，構(gòu)建候選抗性基因富集文

2、庫。探針為根據(jù)抗性基因NBS-LRR類保守序列設(shè)計的簡并特異性引物和特異性引物對野生稻的擴增產(chǎn)物。然后，對富集文庫的克隆進行鑒定分析，包括點雜交和克隆末端測序分析。最后，對富集文庫的克隆進行全序列測定分析和功能驗證。本研究構(gòu)建了東鄉(xiāng)和小粒野生稻可轉(zhuǎn)化基因組文庫，庫容量分別達到97.01％和98.42％，進而構(gòu)建了野生稻候選抗性基因富集文庫，單克隆總數(shù)10368個，對富集文庫的菌落原位雜交篩選獲得22個陽性克隆。陽性克隆末端測序結(jié)果表明，